猪圆环病毒2型2015JS株的分离鉴定及全基因序列分析

采用细胞传代法对PCR检测为猪圆环病毒2型(PCV2)阳性的病料进行病毒分离,通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)对分离的病毒进行初步鉴定,应用IFA测定分离株的TCID50。应用PCR特异性扩增出该分离株的全基因组,经测序后进行同源性和系统进化分析。结果:成功分离到1株PCV2毒株,全基因组长度为1 766 bp,命名为2015JS株,分离株在细胞上的TICD50为10-5.50,与乌拉圭毒株Uy99(Gen Bank登录号KP867050)的同源性最高(99.8%),同属PCV2d型;与丹麦PCV2c毒株DK1980PMWSfree(Gen Bank登录号EU148503)的同源性最低(94.3%)。研究结果为江苏PCV2流行病学的研究和遗传变异的防控提供了参考资料,也为江苏PCV2疫苗毒株提供了选择依据。     

猪圆环病毒2型湖南株的分离及全基因组序列分析

为了解湖南省猪圆环病毒2型(PCV2)的来源及与其他地区毒株的关系,从湖南省疑患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMW S)猪群中分离PCV2毒株1株(PCVHunan),提取病毒DNA,进行PCR扩增,扩增产物经克隆与酶切鉴定,获得1.7 kb片段的阳性重组质粒,对其进行全基因组测序分析,与Genbank中已知全基因组序列进行同源性比较。结果,该序列与国内外毒株核苷酸同源性为93.0%~97.7%,其中与美国株(AR145609)及澳大利亚株(AY424405)同源性最高,为97.7%。2个主要阅读框(ORF1与ORF2)氨基酸序列与国内外毒株同源性分别为98.4%~99.4%和88.0%~95.7%。     

猪圆环病毒2型的全基因克隆和序列分析

参考GenBank中发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因序列,设计一对PCR引物,从病料中扩增获得4株PCV-2的全基因组序列,分别命名为SDNY-PCV-2、ShD-PCV-2、HBbd-PCV-2、GSLN-PCV-2,经测序确定长度均为1 767 bp。应用DNA Star序列分析表明,4个PCV-2分离株与国外部分分离株的核苷酸序列同源性达95.5%~99.8%,与PCV-1毒株的序列同源性为76.2%~77.6%。与国内外部分分离毒株序列进化树分析表明,4个PCV-2分离毒株处于不同分支中,存在一定差异。     

上海市猪圆环病毒2型全基因组的克隆与序列分析

参照国外发表的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,从上海市临床病料中提取PCV-2基因组DNA,进行PCR全基因扩增。回收PCR产物,将其插入pMD18-T载体,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV-2序列与GenBank中登录的国内外PCV-2毒株进行同源性比较。结果显示,PCV-2上海株与国内外毒株的核苷酸同源性高达95.0%～100%。进化树分析结果显示,其中9株PCV-2病毒属于PCV-2b亚型,3株PCV-2病毒属于PCV-2a亚型,且9株PCV-2b亚型毒株部分核苷酸位点显示其属于强毒力毒株。研究表明,上海市PCV-2感染以PCV-2b亚型为主,且氨基酸位点表明其具有较高的毒力。     

猪圆环病毒2型山西株全基因组序列分析

为了解山西省猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异情况,本试验采用PCR方法对山西省分离的4株猪圆环病毒流行株（SXXZ1株、SXXZ2株、SXTY株和SXJZ株）的全基因组进行了扩增、克隆和测序,并将其全基因组序列与国内外34株主要流行毒株进行核苷酸同源性与系统进化树分析。结果显示,4株PCV2山西流行株全基因组核酸序列全长SXJZ株为1 768 bp,其余均为1 767 bp,分别占25%和75%。4株毒株核苷酸同源性为95.9%~100.0%,与国内外34株参考株同源性为94.5%~99.9%,与国产疫苗株同源性为95.6%~99.8%;PCV2全基因组序列进化分析表明,本研究分离的SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株属于PCV-2b基因型,SXJZ株属于PCV-2e基因型,其中SXXZ1株和SXXZ2株与广东QY株的进化关系最近,SXTY与奥地利AUT5株的进化关系最近,SXJZ与福建FJ株的进化关系最近;而SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株与山西PCV2疫苗DBN-SX07-2株的进化关系较近,SXJZ株与国内PCV2疫苗LG株的进化关系较近。从而证实在山西省流行的PCV2毒株以PCV-2b为主,同时还分离出了PCV-2e亚型,表明山西省存在PCV-2e亚型毒株。本试验结果为山西省PCV2的分子流行病学、遗传变异及防控奠定了基础。     

猪圆环病毒2型甘肃株全基因组克隆及序列分析

参照GenBank中登录的猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因组序列,设计合成了两对特异性引物,从甘肃白银疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中提取病毒DNA,分步扩增全基因组。回收PCR产物,将其插入pGEM-TEasy载体,构建了重组质粒pGEM-PCV-2,转化后筛选、提取阳性重组质粒进行测序。结果表明,克隆到的PCV-2全基因组长度为1767bp。应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV-2序列与GenBank中登录的包括甘肃在内的国内外PCV毒株进行同源性分析。结果显示,克隆的PCV-2与英国株(UK-EU656143)遗传关系最近,其核苷酸和推导的氨基酸序列同源性高达96.2%和91.0%,与已报道的2株甘肃毒株(GS03-EU547458,GSLZ-FJ447482)遗传关系较远,可能是流行于甘肃白银的一个变异毒株(GSBY)。     

陕西省部分地区猪圆环病毒2型全基因组的遗传变异分析

为了解陕西省猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况,根据GenBank登录的PCV2全基因组序列,设计1对引物,从陕西省部分地区规模化猪场疑似PCV2感染的病猪采集病料9份,应用PCR扩增PCV2的全基因,其中6份为阳性,并对扩增的6个PCV2全基因组序列进行测序和序列分析。基因测序表明,PCV2基因组全长为1 767bp;对6株病毒序列进行同源性比较,6个毒株全基因之间核苷酸同源性为98.3%~100%,与GenBank上已发表的国内外毒株全基因组比较,同源性为96.3%~97.8%;与近几年陕西株比较发现基因变异程度不稳定,与2013年分离株(KX352154.1)同源性最高,2015年分离株(KX352159.1)次之,反而与2014年分离株(KX068219.1)最低;对6个毒株的ORF1和ORF2基因进行同源性比较,6个毒株的ORF1和ORF2基因的核苷酸同源性分别为98.1%~100%和98.2%~100%,与GenBank上已发表的国内外参考株ORF1和ORF2基因进行同源性比较,同源性分别为97.6%~99.8%和91.5~96.0%。陕西省流行的PCV2基因组较为保守,变异不大,同源性很高。     

猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组克隆和序列分析

通过PCR方法对采自四川省某规模化猪场一批疑似断奶仔猪多系统衰弱综合征病例的肺脏、淋巴结进行PCV-2的抗原检测,并将检测结果为阳性的对应组织研磨、过滤除菌后接种无PCV-1污染的PK-15细胞,盲传15代后,IFA方法检测出有明显的特异性荧光,将该毒株命名为PCV-2-SC株,并对PCV-2-SC病毒基因组全长进行扩增及克隆、测序与比对分析。测序结果显示该病毒基因组全长1 767bp,分离株与国内外参考毒株核苷酸序列相似性在95.2%～99.5%之间,进化树分析表明,PCV-2分离毒株在进化上存在地域相关性。PCV-2四川株的分离鉴定为其诊断试剂的研制及检测方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒2型细胞毒(MNS株)的驯化及全基因组序列分析

为了解猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)与参考毒株之间在分子生物学水平上的差异以及病毒驯化过程中的遗传变异情况,将分离的猪圆环病毒2型MNS株在PK-15细胞上盲传35代,并对4个代次病毒全基因组进行测序与分析。间接免疫荧光试验结果表明,感染细胞的细胞核中可以观察到特异性绿色荧光。病毒传代驯化到第35代后,病毒对细胞的适应性显著提高,病毒含量最高可达107TCID50/m L。对4个代次接种病毒Z0、Z3、Z19、Z35进行全基因组测序,结果表明,4代次细胞毒与PCV2参考毒株之间的全基因组序列同源性为93.9%~96.3%,与参考株af55394(PCV2b)核苷酸同源性较高。4代次细胞毒之间全基因组序列同源性为99.7%~99.9%,通过分析PCV2全基因组中碱基突变结果,发现各代次细胞毒与参考毒株之间存在19处点突变,16处点突变发生在ORF1中,3处发生在ORF2中。其中,ORF1 751~753 nt处发生基因颠换(TACGC→TTTTG)现象。本研究结果对今后进行PCV2复制机制、遗传变异以及开发高效价的病毒灭活疫苗等方面的研究奠定了基础。     

辽宁地区猪圆环病毒2型全基因克隆与序列分析

本试验旨在为辽宁地区猪圆环病毒2型(PCV2)的流行病学调查及选择同源性高的毒株进行灭活疫苗研制奠定基础。采集辽宁沈阳、朝阳、铁岭、大连等地疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)患病仔猪的病料,利用PCR方法进行PCV2特异性检测,对10份阳性病料进行全基因组克隆和测序分析。结果显示,10株PCV2辽宁株全为强毒株,9株全长1767 bp,1株1768 bp,差异是在1039 bp处多了1个T碱基。与GenBank中的两株疫苗株(HM038034、JQ692110)的核苷酸同源性为95.1%~98.5%,在遗传进化树上,JHZ2为PCV2a型,其余9株毒株为PCV2b型,并且DLS38、LYD32、SYX7在同一小分支,都是同年2~3月发病。10株PCV2 ORF2的氨基酸同源性为89.6%~100.0%,变异度大,存在35个变异点,以突变为主,唯一的糖基化位点(NYS)保守。结果表明,10株辽宁株PCV2抗原性没有明显变化,说明近年来辽宁省猪群中PCV2相关疾病(PCVD)不是因PCV2出现变异株引起的,并且PCV2b型为主要流行型,怀疑PCV2的流行与季节性有关。     

4株猪圆环病毒2型凉山州分离株全基因组进化分析

为了解猪圆环病毒2型(PCV2)凉山州分离株的基因型,本研究采用PCR方法对采自凉山州3个发病猪场的4个PCV2阳性样品进行全基因组序列的扩增、克隆、测序分析,并绘制遗传进化树.结果显示:4个PCV2凉山州分离株全基因组序列长度均为1767 bp,核苷酸同源性为99.4％～99.8％,与国内外101株PCV2参考毒株核...     

猪圆环病毒2型田间分离株的全基因组克隆与基因亚型分析

为了解我国猪圆环病毒2型(PCV2)的流行态势和毒株的基因变异情况,从北京、江苏、湖北等地疑似断奶仔猪多系统综合征(PMWS)患病死亡猪中采集肺脏、脾脏和淋巴结等组织,将PCR鉴定为阳性的病料在PK-15细胞上进行增殖培养,成功分离到6株猪圆环病毒2型毒株,分别命名为B07、B12、HB、LHW、LPC和NJ。对其全基因组进行克隆和序列分析的结果显示,LPC基因组全长为1766 bp,其余均为1767 bp;6个毒株序列之间同源性高达96.0%~99.9%,6个毒株与参考毒株序列的同源性为94.4%~99.8%。PCV2全基因组的进化分析结果表明,B12、HB、LHW、LPC和NJ为PCV2b亚型,B07为PCV2d亚型,从而证实PCV2b亚型毒株成为我国猪群中分离率较高的流行毒株,并且我国猪群存在PCV2d亚型毒株。     

猪圆环病毒2型全基因组序列分析及Cap蛋白CTL表位预测

【目的】监测当前湖南省猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株及其衣壳蛋白(capsid protein, Cap)变异情况,并预测Cap蛋白细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位,为新型PCV2疫苗研制和病毒净化提供参考依据。【方法】本研究对2019-2021年于湖南省6个地区收集的17份PCV2阳性组织样品进行PCV2全基因组序列扩增及测序分析,绘制系统进化树,利用生物信息学方法分析Cap蛋白氨基酸变异情况,并预测CTL表位。【结果】系统进化树显示,获得的17株PCV2全基因组序列中,1株PCV2a、7株PCV2b和9株PCV2d。Cap蛋白氨基酸序列比对分析发现,共有16个氨基酸残基突变位点位于病毒Cap蛋白表面,且有11个突变位点参与构象型表位的形成。此外,共预测出9个PCV2 Cap蛋白潜在的CTL表位,其中4个表位(16-24、28-36、136-144和179-187位氨基酸)在GenBank的1 610株PCV2不同基因型毒株中高度保守。通过TCR-pMHC复合物3D结构对4个保守性...     

猪圆环病毒2型吉林分离株全基因组的克隆与序列分析

从吉林某猪场采集疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征死亡的猪体病料,进行猪圆环病毒2型(PCV-2)的分离;分离培养物经荧光标记的PCV-2特异抗体染色鉴定,并用PCV-2全基因组的特异性引物扩增,进行序列测定和分析。结果表明,从采集病料中成功分离出一株猪圆环病毒2型,并将此吉林分离株命名为PCV-2-JL11S,对其进行全基因测序,拼接结果显示,基因组全长为1 767bp;将分离株病毒的全基因组序列与14株GenBank已登录病毒进行比较,结果显示,核苷酸同源性最高可达99.2%;全基因序列系统进化树结果表明,分离株与HQ395057关系最近,而与HQ395037关系较远。上述结果表明,PCV-2吉林分离株存在一定的基因变异,而变异的发生原因尚需深入研究。     

Cloning and Sequence Analysis of Complete Genome of Porcine Circovirus Type 2 from Liaoning Province

It was aimed to lay a foundation for epidemiological survey of porcine circovirus type 2(PCV2) in Liaoning province and selection of highly homologous strain inactivated vaccine.Some pigs suspected of having postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) from Shenyang,Chaoyang,Tieling,Dalian and other places in Liaoning province,were detected by PCR method,then the whole genome of 10 positive samples were cloned and sequenced.The result showed that all of them were virulent strains,9 strains were 1767 bp and 1 strain was 1768 bp,and there was a T base additon at 1039 bp.The nucleotide homology was 95.1% to 98.5% with HM038034 and JQ692110.In the phylogenetic tree,JHZ2 was PCV2a type,the other 9 strains were PCV2b type,DLS38,LYD32 and SYX7 were in the same branch and same onset time.The amino acid homology of ORF2 was 89.6% to 100.0%,there were 35 mutation points,large degree of variation,the only glycosylation site (NYS) was conserved.10 strains did not change significantly,mutants were not due to PCVD,PCV2b was the predominant type,and PCV2 was related with seasonality.     

猪圆环病毒2型滨州分离株全基因组的克隆与序列分析

为了解猪圆环病毒2型(PCV-2)滨州地方分离株的起源及遗传变异,从滨州不同区域疑似病猪病料中克隆了3株PCV-2的全基因组序列,并进行序列测定及分析。核苷酸同源性比较显示,PCV-2分离株BZ-1、BZ-2及BZ-3与GenBank上登录的14株PCV-2同源性为95.6%~99.9%;核苷酸遗传进化树分析显示,BZ-1株与BZ-3株处在同一分支,而BZ-2株处在另一分支。     

猪圆环病毒2型辽宁株全基因组克隆与序列分析

本试验从辽宁地区某猪场疑似患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪群中采集病料,采用PCR方法进行猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的检测,在此基础上对阳性病料进行PCV2全基因组克隆和序列分析。结果表明,PCV2辽宁分离株基因组全长为1768 bp,与国内外PCV2分离株的同源性为95.9%~99.5%,其中与丹麦分离株(EF565365)、澳大利亚分离株(AY424405)和江苏分离株(FJ158606)同源性最高,均为99.5%;与广东分离株(JX912915)同源性最低,为95.9%。