白鸡冠茶树CsPPH基因全长cDNA克隆与表达分析

脱镁叶绿素酶（Pheophytinase,PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶,它能使脱镁叶绿素a转化为脱镁叶绿酸a,脱镁叶绿酸a是叶绿素降解途径中最后一个保持植物绿色的产物,被认为是叶片衰老和黄化的关键步骤。以新梢白化茶树白鸡冠叶片为材料,克隆获得CsPPH基因cDNA的全长序列（登录号：MK359094）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,CsPPH全长为1 298 bp,包含的ORF序列为1 241 bp,编码413个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定疏水蛋白,其预测分子量为45 741.50 Da,理论等电点为6.12。预测该基因主要定位于叶绿体中。qRT-PCR结果显示,遮荫抑制白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素升高,叶色变绿;光照促进白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素降解,导致叶片白化。     

茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT的克隆与表达分析

以白叶1号为试验材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆获得茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT（GenBank登录号：KJ652972）。CsPPT完整ORF长度为1β227βbp,编码408个氨基酸,蛋白分子量为44.7βkDa,理论等电点为10.16;无信号肽位点,属于非分泌型蛋白;建立了茶树CsPPT蛋白的系统发育树;磷酸化修饰预测该蛋白质多肽链中共有26个磷酸化位点;TMHMM预测表明CsPPT蛋白为跨膜蛋白;亚细胞定位发现,CsPPT蛋白定位于叶绿体上,推测CsPPT蛋白可能定位于叶绿体膜上。荧光定量PCR结果表明CsPPT基因在茶树花中表达量最高,其次为芽、叶和嫩茎,根中最低。     

茶树LOX基因家族的鉴定及其在白茶萎凋过程的表达分析

脂肪族类化合物是植物芳香物质的重要组成部分,对白茶香气的形成具有重要作用。利用生物信息学方法,在染色体级别的茶树基因组数据库中,对LOX基因家族进行鉴定,从中获得12个茶树LOX基因家族成员,命名为CsLOX1~CsLOX12。12个茶树LOX基因序列,主要定位于细胞质或叶绿体中,其编码蛋白具有相同的特征结构域及保守基序。系统进化树分析表明LOX基因家族分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,CsLOX2、CsLOX3、CsLOX4、CsLOX7为9-LOX亚型,其余为13-LOX亚型;基因结构分析表明CsLOX1含有8个外显子,其余均含有9个外显子;不同组织转录组数据分析结果表明,该家族在茶树嫩叶、成熟叶部位高表达;上游启动子区域分析发现大量与植物生长发育、光响应、激素及胁迫响应密切相关的顺式作用元件。荧光定量PCR检测发现,CsLOX基因家族在干旱、低温及茉莉酸甲酯处理下均有不同程度的表达,在白茶不同萎凋时间处理下,CsLOX1、CsLOX3、CsLOX5、CsLOX7、CsLOX8、CsLOX9、CsLOX11和CsLOX12的表达量被诱导上调,4 h时表达量最高（最高上调27倍）。结果表明,CsLOX基因家族成员参与白茶加工萎凋过程脂肪族香气形成的调控,为探明白茶加工过程香气形成的分子机制奠定基础。     

茶树CsAAPs亚家族基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术,从龙井43中成功克隆了5个茶树AAPs（Amino acid permeases,氨基酸通透酶）基因。氨基酸序列比对结果表明,5个CsAAPs亚家族蛋白的序列同源性较高,为70.27%。根据氨基酸序列同源性构建系统发育树,结果显示5个CsAAPs分属3组。生物信息学分析表明,CsAAPs均含有9~10个跨膜区域和16~18个AAP保守基序。为了研究该亚家族对氮素的响应情况,选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,氮饥饿两周后,分别供应不同浓度的NH₄NO₃,然后利用qRT-PCR对CsAAPs在不同组织、氮素水平及茶树品种中的表达情况进行分析。研究发现CsAAPs在营养组织中均有表达,但是存在一定的组织表达差异,其中CsAAP3在茎中表达量最高,CsAAP8的主要表达部位为根和茎。在给氮素饥饿处理的茶苗从新供氮之后,CsAAP3的基因表达在3个氮素利用效率不同的品种间差异较大;在氮高效品种中茶302茎中表达的CsAAP3和CsAAP8,可以快速地对低氮条件做出响应,在低氮处理3 h后,基因表达水平明显增加。此研究预示着CsAAPs亚家族在茶树体内可能通过复杂的氨基酸转运参与氮代谢调控。     

茶树硝酸根转运蛋白基因NRT2.5的克隆及表达分析

通过RACE克隆从茶树[Camellia sinensis (L.)]叶片中获得NRT2.5基因cDNA全长序列。所得基因序列全长为2 457 bp,其中开放阅读框为1 362 bp,编码454个氨基酸,推测蛋白分子量为48.7 kD,理论等电点为9.63。生物信息学分析表明,该基因与可可树、拟南芥等的NRT2.5基因具有高度同源性,且其编码的蛋白质具有NRT家族共有的结构特征。实时定量PCR分析表明,NRT2.5基因在茶树不同组织中均有表达,但主要在成熟叶和根中表达;不同氮浓度处理后,茶树NRT2.5基因在低浓度下的表达量高于高浓度下。     

茶树小G蛋白CsRAC5基因的克隆与低温胁迫下的表达分析

小G蛋白是一类重要的信号转导蛋白,参与植物的各项生命活动,但目前在茶树中的研究尚少。本研究以茶树品种龙井长叶为实验材料,克隆获得1个小G蛋白基因,命名为CsRAC5。序列分析显示,CsRAC5含有597βbp,编码198个氨基酸,具有Rho蛋白的保守结构域;序列多重比对发现,该序列与其他物种序列的一致性高达95.96%。CsRAC5蛋白质的相对分子质量为21.79βkDa,为亲水性蛋白;烟草瞬时表达实验显示,CsRAC5定位于细胞膜和细胞核中。荧光定量PCR结果显示,CsRAC5在茶树中的表达具有明显的组织特异性,其中在叶片中的表达最高,在花粉中的表达最低;低温（4℃）胁迫抑制茶树叶片中CsRAC5的表达。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

茶树CsbHLH2基因克隆及表达分析

植物bHLH（碱性螺旋环螺旋）转录因子是植物体内一类重要的转录因子,在植物的生长发育以及胁迫应答过程中发挥着重要的调控作用。本研究以茶树品种陕茶一号为材料,采用同源克隆法从陕茶一号叶片cDNA中克隆了1个bHLH转录因子CsbHLH2。生物信息学分析表明,CsbHLH2开放阅读框（ORF）为714βbp,编码1个297个氨基酸的蛋白,预测分子量58.4βkD,等电点为5.14,氨基酸序列比对显示该蛋白与其他高等植物的bHLH蛋白具有较高同源性。拟南芥原生质体亚细胞定位表明,CsbHLH2编码蛋白定位在细胞核上。实时荧光定量PCR结果分析表明,CsbHLH2基因在茶树不同组织部位中均有表达,但是在幼叶中表达量最高;不同激素处理结果显示,CsbHLH2受SA、ETH、MEJA诱导。     

茶树CsCHLI基因的克隆及其在不同叶色白化茶树中的表达分析

镁离子螯合酶是叶绿素合成过程中的关键酶之一,与植物叶色的白化现象密切相关.以陕茶1号、白叶1号、极白1号、黄金芽和黄金叶等5个茶树品种叶片为试验材料,分别克隆其镁离子螯合酶I亚基(Mg-chelatase I subunit,CHLI)编码基因CsCHLI全长CDS序列.多序列比对显示,白叶1号中两个碱基差异位点(G5...     

黄金芽不同色泽叶片生理特性研究

为筛选用于黄金芽叶色黄化分子机理研究的适宜材料,采用双层遮荫（平均光强约10βklx）、单层遮荫（平均光强约40βklx）和不遮荫3种光照强度处理黄金芽春梢,获得嫩绿色（H_1W）、浅黄稍带绿色（H_4W）、明黄色（Hs）3种新梢,同时以福鼎大白绿色新梢（CK_f）为对照,选择芽下第二叶为材料,通过测定H₂O₂、O₂^-含量和组织化学定位、抗氧化物酶活性、光合响应曲线、叶绿素荧光等叶片生理指标,观测叶绿体膜系统结构。结果表明,浅黄稍带绿叶片H_4W的H₂O₂、O₂^-含量、Fv/Fm值和叶绿体膜系统情况与嫩绿色叶片H_1W相近,处于未受逆境胁迫的生理状态;同时浅黄叶片H_4W与明黄叶片Hs具有相似的黄化叶光合生理特性,两者在ΦPSⅡ、qP、光饱和点、光补偿点等叶绿素荧光参数和光合指标上差异不显著,光响应曲线特征相似。由于浅黄稍带绿叶片（H_4W）所具有的上述生理特点,推测其是探究黄金芽茶树品种黄化分子机理必不可少的研究材料。     

外源5-ALA对干旱胁迫下茶树叶绿素合成和荧光特性及关键酶基因表达的影响

为探究外源5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)在茶树幼苗响应干旱胁迫时对茶树叶绿素合成和荧光特性的调控机理,以舒茶早为试验材料,PEG-6000模拟干旱胁迫环境,喷施5-ALA进行处理,检测茶树幼苗叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量,进一步测定叶片叶绿素荧光参数及关键酶基因的表达.结果显示,外源5-ALA显著提高干旱胁迫...     

茶树CsCML16基因的克隆及其低温胁迫下的表达分析

类钙调蛋白CMLs(CaM-like proteins)是植物体内一类重要的钙信号转导蛋白,在抗非生物胁迫中发挥重要作用.以龙井43、福鼎大白茶和黄金芽的一年生茶树扦插苗为材料,通过低温处理(10℃和4℃)分析茶树在低温胁迫下的生理变化;通过克隆茶树类钙调蛋白CsCML16,分析其在低温胁迫下不同抗寒性茶树品种中的表达...     

四川3个特色茶树品种芽叶性状及光合特性分析

为明确峨眉问春、川茶2号、紫嫣等3个四川特色品种的光合性能和生产潜力,本研究以常绿品种福鼎大白茶和紫化品种紫娟为对照,考察了3个品种春夏梢叶片的光合指标、叶绿素荧光、光合色素含量以及芽叶性状。结果表明,川茶2号的春、夏季的叶片净光合速率（P_n）和水分利用率（WUE）较高;其ΦPSⅡ原初光能转化效率（F_v/F_m）和潜在活性（F_v/F₀）最高,光化学猝灭系数（qP）、光系统ΦPSⅡ能量分配中光化学反应的相对份额（P）和反应中心耗散的相对份额（E_X）及类胡萝卜素含量较高。峨眉问春的春季P_n和WUE最高;但夏季P_n较低,其ΦPSⅡ原初光能转化效率（F_v/F_m）和潜在活性（F_v/F₀）最低,光合电子传递速率（ΦPSⅡ有效光化学效率F_v'/F_m'及ΦPSⅡ实际光合能力PhiPS2）最慢。紫嫣的春、夏季ΦPSⅡ有效光化学效率（F_v'/F_m'）最高,P_n及光合色素含量较高。与春季相比,各品种的夏季蒸腾速率（T_r）和气孔限制值（L_s）升高,而WUE和胞间二氧化碳浓度（C_i）降低。产量方面,川茶2号的产量显著高于其他品种,峨眉问春的产量与福鼎大白茶的差异不显著,紫嫣则显著低于福鼎大白茶（P<0.05）。可见,川茶2号的光合效率和水分利用效率较高,其产量最高;峨眉问春的春季光合能力和水分利用率较高,但夏季较低,其产量较高;紫嫣的光合色素及光合能力较高,但产量较低。     

茶树Na+/H+逆向转运蛋白基因CsNHX1、CsNHX2的克隆及表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（Na⁺/H⁺ antiporter,NHX）在植物生长发育与逆境响应过程中扮演着重要角色。本研究以龙井长叶茶树品种为材料,克隆获得了茶树CsNHX1和CsNHX2基因cDNA全长序列,GeneBank登录号分别为：MG722977和MG515211。生物信息学分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2的cDNA全长分别为1β691βbp和1β757βbp,均包含1个1β626βbp的开放阅读框,编码541个氨基酸,预测分子量为59.5βkD和59.7βkD,理论等电点为7.07和8.79;蛋白序列分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2属于典型的跨膜蛋白,均含有保守的Na⁺/H⁺ Exchanger结构域;进化树分析显示,CsNHX1和CsNHX2均为IC类中定位于液泡膜上的Class I成员。qRT-PCR结果显示,干旱、低温和盐胁迫能够显著诱导CsNHX1和CsNHX2上调表达;外源ABA处理下,CsNHX1和CsNHX2表达水平整体变化趋势不显著;高温胁迫处理下,茶树CsNHX1表达水平显著降低,而CsNHX2表达水平逐渐增加,表明茶树CsNHX1和CsNHX2参与了茶树对多种环境胁迫的响应过程,但对于不同逆境胁迫的应答模式存在一定差异。     

茶树cpDNA测序及基于cpDNA序列的山茶属植物亲缘关系研究

叶绿体基因组在物种鉴定、系统进化分析及亲缘关系研究等领域应用前景广阔。本文应用Illumina高通量测序技术对龙井43（Camellia sinensis cv. Longjing 43）的叶绿体全基因组进行测序;利用叶绿体trnL-trnF序列研究茶树及其近缘植物的亲缘关系。结果表明,龙井43叶绿体基因组全长为157 096 bp,反向互补重复区（Inverted repeat, IR）为26 080 bp,小单拷贝区（Small single copy region, SSC）、大单拷贝区（Large single copy region, LSC）分别为18 283 bp、86 653 bp。共注释叶绿体基因133个,其中蛋白编码基因86个,rRNA基因8个,tRNA基因39个。对所选植物的trnL-trnF序列进行比对,序列长度变异范围为481~501 bp,序列最长为岔河大茶,最短为金花茶,基于此序列构建亲缘关系树,山茶属茶组植物聚成一个组。研究结果对茶树优良品种培育及山茶属植物亲缘关系的研究具有重要价值。     

茶树CsMDHAR基因的克隆与非生物胁迫响应分析

基于茶树转录组数据,以龙井43茶树cDNA为模板,克隆得到开放阅读框（ORF）长度为1β305βbp,编码434个氨基酸的茶树单脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为CsMDHAR。蛋白序列特征和基因表达模式分析表明,CsMDHAR蛋白含有FAD结合功能域,属于FAD依赖的吡啶核苷酸-硫基氧化还原酶（Pyr-redox-2）家族。该蛋白有两个无序化区域,而且包含有32个磷酸化位点,理论相对分子量为47.21βkDa,pI为5.99,属于亲水性蛋白;CsMDHAR蛋白二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。通过PlantCARE和PLACE对启动子上游调控元件进行分析预测,结果显示,CsMDHAR基因启动子上游1β000βbp中含有多个与光、激素以及植物抗逆有关的顺式作用元件。利用荧光定量PCR方法检测龙井43和迎霜的CsMDHAR、CsAO和CsAPX在4种不同非生物胁迫下的表达水平,结果表明,在低温（4℃）胁迫下,两个茶树品种的CsMDHAR、CsAO和CsAPX的表达均受抑制,且品种间的差异较小;在高温（38℃）和干旱（200βg·L^-1 PEG）胁迫下龙井43中的CsMDHAR表达均上调,分别在8βh和2βh时达到最大值,为对照的1.49倍和1.85倍;盐（200βmmol·L^-1 NaCl）胁迫下,CsAO和CsAPX在两种茶树品种中的表达量变化趋势相似,但变化幅度不同,可能与品种间不同的抗逆性有关。     

茶树乙醇脱氢酶基因家族的鉴定及其在白茶萎凋过程的表达分析

乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)作为植物香气物质合成的脂肪酸代谢等途径中关键酶之一,对茶叶芳香物质的形成有着重要作用.从茶树染色体级别的基因组数据库中鉴定到19个CsADH基因家族成员.系统进化树显示,茶树的ADH基因家族成员分成6个亚家族;共线性分析发现,茶树和拟南芥、葡萄与猕猴桃的A...