利用CRISPR/Cas9技术突变BnaMPK6基因降低甘蓝型油菜的耐盐性

甘蓝型油菜是我国一种重要的油料作物。MPK6是一种丝裂原活化蛋白激酶, MAPK级联途径可以被各种胁迫激活,进而调节植物对胁迫的响应,在植物响应非生物胁迫过程中发挥着重要的作用,但在甘蓝型油菜盐胁迫响应过程中的功能还尚不清楚。基因结构和蛋白序列分析表明,MAPK6在十字花科芸薹属植物种间分化相对保守,基因结构相似,蛋白之间均有相同的STKc＿TEY＿MAPK结构域,与胁迫和生长发育相关。为探究其功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术对BnaMPK6基因进行编辑,通过农杆菌介导的方法将BnaMPK6基因转入到甘蓝型油菜中,获得了BnaMPK6基因4个同源拷贝同时突变的材料:cr-bnampk6-13-1和cr-bnampk6-49-1。cr-bnampk6突变体表现出明显的盐敏感性:在100 mmol L^–1和150 mmol L^–1浓度的NaCl溶液处理下,功能缺失突变体长势明显缓慢,并且株高和鲜重显著低于野生型植株,但根长无明显差异。此外,在盐胁迫下,功能缺失突变体体内的活性氧和丙二醛含量的积累显著高于野生型对照,脯氨酸含量也明显高于野...     

甘蓝型油菜BnaABI4基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建及甘蓝型油菜转化

ABI4(Abscisicacid-insensitive4)是ABA响应途径中重要的转录因子。本研究以甘蓝型油菜全基因组数据库为基础,借助拟南芥ABI4蛋白的氨基酸序列,通过序列比对,获得了甘蓝型油菜的2个BnaABI4,分别命名为BnaABI4-A (GenBank登录号为BnaA03g18970D)和BnaABI4-C (GenBank登录号为BnaC03g725-10D)。在这两个基因的CDS序列上寻找一段长度为20 bp、序列相同的片段作为基因编辑的目标位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pCAMBIA1300-sg RNA/Cas9-BnaABI4;借助根癌农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化法,成功将BnaABI4的基因编辑表达框转入甘蓝型油菜‘湘油15’中,共获得转基因植株13株,这将为深入研究甘蓝型油菜BnaABI4的生物学功能提供科学依据。     

通过优化gRNA设计提高CRISPR/Cas9系统中基因编辑效率的方法

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于动物、植物、真菌、细菌的新一代基因定点编辑技术,如何提高g RNA的编辑效率是该技术的关键点也是许多研究者关注的焦点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对番茄miR167a前体序列进行基因编辑,根据番茄miR167a前体序列在线设计候选g RNA,同时结合体外编辑检测的方法筛选出能够在体外成功编辑的g RNA-G1,把其连接到含有荧光标记的pP1C.1C表达载体,转化番茄子叶,产生愈伤组织数116个,得到5个含有表达载体的材料,经测序发现,其中3个材料发生了编辑。结果表明,通过体外检测和在线软件设计相结合的方法来快速检测g RNA的编辑效率,能筛选出最优的g RNA用于载体的构建,与未采用体外编辑检测来设计g RNA的方法相比,显著提高了CRISPR/Cas9的编辑效率。本研究通过优化g RNA,创新了一种高效利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的方法。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因tgw6突变体的创建

利用CRISPR/Cas9技术对调控水稻产量千粒重基因TGW6定点编辑,获得了一套有重要育种价值的tgw6突变体。设计了分别由U3、U6a和U6b启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑TGW6基因的外显子,首先将这3个靶点一起组装到pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上,然后利用农杆菌介导侵染水稻材料H447 (R819/玉针香//R819的BC₃F₆);提取T₀代转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明,T₀代材料中tgw6的突变频率高达90%,其中纯合缺失突变率约占51%。对T₁代纯合缺失突变体的千粒重性状的调查分析结果表明,部分tgw6的缺失突变能显著提高千粒重(大于5%)。不同类型tgw6突变体的成功创建不仅丰富了tgw6的变异类型,为水稻的高产稳产奠定了重要的材料基础,还证实了CRISPR/Cas9技术在水稻基因工程育种中高效、易操作的特点,具有重要的理论与实践意义。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsCOL9水稻突变体

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端,分别由U3、U6a、U6b以及U6c启动子驱动,提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明,T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp,突变次数最多可达11次,取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应,因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入,加上该技术的快捷、简便,对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术的生物伦理和法律问题

CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一项革命性的生物技术,为基因组编辑提供了高效、精准的工具,然而其广泛应用也引发了众多生物伦理和法律挑战。本研究旨在探讨CRISPR/Cas9基因编辑技术在生物伦理和法律层面所面临的问题。本研究介绍了CRISPR/Cas9技术的基本原理和其在生物学、农业等领域的应用,详细探讨了基因编辑技术可能引发的伦理问题,包括人类基因编辑的道德边界、遗传信息的安全性等,还分析了基因编辑技术在法律方面的挑战,如知识产权、监管标准和医疗法律责任等。通过综合评述生物伦理和法律领域的争议和讨论,本研究旨在促进对CRISPR/Cas9基因编辑技术应用的全面理解和审慎考虑。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在玉米分子育种中的应用概述

玉米是我国第一大粮食作物,有效提升玉米产量和品质对保障我国粮食安全起着至关重要的作用。简要论述了CRISPR/Cas9 基因编辑技术研究历程、编辑类型和作用原理,以及在功能基因验证、玉米产量、品质改良和抗逆育种方面的应用,说明了在玉米基因组水平上进行基因定向编辑改造对玉米分子育种具有重要研究和应用价值。通过借鉴相关国家对基因编辑作物进行监管的措施,为不断完善我国的监管政策提出了一些对策建议。     

基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具, 目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子, 分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料, 制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sgRNA和CAMV35S::Cas9两部分), 并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR, 成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序, 结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主, 少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能, 为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。     

Genes for race-specific resistance against blackleg disease in Brassica napus L.

Specificity of interaction at the cotyledon stage was recently demonstrated between the blackleg pathogen, Leptosphaeria maculans, and Brassica napus. Three pathogenicity groups were distinguished, PG2 avirulent towards ‘Quinta’ and ‘Glacier’, PG3 avirulent towards ‘Quinta’, and PG4 virulent on the two cultivars. The genetic control of the interactions was investigated on both the pathogen and the plant. Tetrad analysis was performed following PG3 × PG4 and PG2 × PG4 crosses.‘Quinta’ and ‘Glacier’ were crossed with the susceptible winter oilseed rape cultivar ‘Score’. The analysis of F₁, F₂ and testcross populations suggested that the incompatible interaction between ‘Quinta’ and PG3 isolates is conditioned by the presence of the dominant single resistance allele Rlml in ‘Quinta’ and the matching avirulence gene AvrLml in L. maculans. Race-specific resistance of ‘Glacier’ to PG2 isolates was conditioned by the matching gene pair Rlm2/AvrLm2. Finally, the data suggest that two avirulence genes matching two dominant loci control the ‘Quinta’-PG2 interaction. The consequences of the occurrence of race-specific resistance in B. napus are discussed with respect to future breeding for blackleg resistance.     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在作物品种改良中的应用

基因组编辑技术是用特殊的核酸酶对基因组进行精准修饰的一种新兴技术。2013 年研究人员发现了CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统,将其中的CRISPR/Cas9 系统成功改造成RNA引导的核酸内切酶,发展了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术。该技术能够对包括植物在内的几乎所有物种的基因组进行高效、精准的定点修饰,而且程序简易、操作方便灵活,加速了遗传工程、功能基因组学的研究,给生命科学的各个领域带来了革命性变化。本综述回顾了CRISPR/Cas9 的出现、改进与发展,简述了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术的作用机理,归纳总结了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术在作物品种改良、提高作物品质和产量中的应用,最后,分析了该技术在作物品种改良中的发展前景及应用价值,以期为合理利用该技术进行种质创新、品种改良提供理论依据。     

Functional Identification of Cotton U3 and U6 Promoters in the CRISPR/Cas9 Genome Editing System

[Objective] The function of U3 and U6 promoters that were cloned from sea-island cotton were identified in order to provide more available U3 and U6 promoters for the construction of cotton CRISPR/Cas9 multi-sites gene editing system. [Method] Two CRISPR/Cas9 gene editing vectors were constructed, in which sgRNA were driven by GbU6-7P and GbU3-2P, respectively, and GGB, a negative regulator in drought tolerance, was used as target gene. The function of the vector were identified in cotton leaf protoplast of Xinhai 16. The core fragment of CRISPR/Cas9 gene editing vector were enriched by Polymerase chain reaction method and were delivered into protoplast through PEG transient transformation. Then genomic DNA were extracted from protoplast. Gene mutations were analyzed using Enzyme digest/Polymerase chain reaction and sequenced. Finaly the mutation efficiencies of the CRISPR/Cas9 system were calculated and the frequency distribution of the mutation in target site were drawn in order to confirm the authenticity of the mutation. [Result] All type of mutation in target loci were base substitution. [Conclusion]Both CRISPR/Cas9 gene editing systems based on GbU3-2P and GbU6-7P promoters could successfully edit the sequence of cotton GGB gene and cause gene mutation.     

基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究

CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明, 2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。     

基于SNP遗传图谱定位甘蓝型油菜分枝角度QTL

分枝角度是油菜株型的重要性状,与油菜的耐密植性密切相关。本研究利用油菜分枝角差异显著的育种亲本材料1098B (分枝角小)和R~2 (分枝角大)杂交获得F1,通过小孢子培养获得含163份株系的DH群体。以油菜60K SNP芯片进行DH群体基因分型,构建高密度遗传图谱,并利用QTL Cartographer 2.5对2个环境下油菜顶端分枝角和基部分枝角进行QTL分析。结果表明,构建的高密度遗传图谱覆盖甘蓝型油菜19条染色体,包含9521个多态性SNP标记, 1442个簇(bin),覆盖基因组长度为2544.07 cM,相邻簇(bin)之间平均距离为1.76 cM。在此图谱基础上采用复合区间作图法(CIM),在2个环境下检测到17个分枝角度QTL,分别位于A01、A02、A03、A06、A09、C02、C03、C04、C06和C08染色体上,单个QTL解释的表型变异为6.39%～21.78%。用比较基因组方法与拟南芥分枝角度同源基因区间比对,鉴定出其中6个QTL的12个候选基因。其中位于A03连锁群QTL在2年的试验中被重复检测到,根据物理位置和基因组信息推测VAMP714为分枝角度的候选基因。这些QTL和候选基因将为油菜分枝角度的遗传改良提供有用的信息。     

甘蓝型油菜菌核病抗性的遗传分析

利用牙签接种和花瓣接种鉴定了甘蓝型油菜DH821（抗）×DHBao604（感）组合P₁、P₂、F₁、BC₁、BC₂、F₂ 6个世代群体菌核病的抗性，通过主基因-多基因混合遗传模型分析表现，牙签接种3 d的抗性受2对加性主基因+加性-显性多基因控制，BC₁、BC₂、F₂ 群体主基因遗传率为12.49%~28.48%，多基因遗传率为21.08%~27.87%；5 d的抗性由2对加性-显性-上位性主基因控制，显性及显性互作效应明显，无多基因修饰，BC₁、BC₂、F₂群体主基因遗传率为25.19%~38.69%；3~5 d的菌丝扩展抗性由2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因控制，主基因效应明显，多基因效应不明显，BC₁、BC₂、F₂ 群体主基因遗传率为0.72%~54.06%，多基因遗传率为7.34%~46.79%。花瓣接种15 d的抗性由2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因控制，2对主基因的加性效应和显性效应为－3.6051~ －3.5225，互作效应为3.5190~3.6089，主基因遗传率为0.91%~41.79%，多基因遗传率为19.32%~73.69%。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻温敏不育基因tms5突变体的构建

为创新优良温敏不育系, 促进两系杂交稻育种的发展, 我们以水稻温敏不育基因TMS5为编辑对象, 设计了由水稻U3启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑 TMS5 基因的第1个外显子, 将靶点与表达载体pCAMBIA1301连接, 再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系。提取T₀代转基因株系的基因组DNA, 并对TMS5编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明, T₀代植株的突变率为63.89%, 其中纯合缺失突变率为34.78%。对T₁代纯合缺失突变体的不育起点温度和农艺性状调查分析结果表明, 28℃是tms5突变体花粉育性的转换温度。大田试验结果表明, 与野生型相比, tms5突变体的结实率和单株重均显著降低。粳稻tms5突变体的获得为培育粳稻不育系奠定了材料基础。     

以半冬性甘蓝型油菜为亲本增强春性甘蓝型油菜杂种优势

以春性恢复系与半冬性品种(系)杂交后选育的16份新春性恢复系及其4个亲本系[2个半冬性甘蓝型油菜品种(系)和2个春性甘蓝型恢复系]、2个春性甘蓝型不育系为材料, 利用SSR、SRAP和AFLP分子标记技术分析材料间的遗传差异, 同时利用以上2个春性不育系分别与12个新春性恢复系和1个春性亲本恢复系Ag-5进行NCII双列杂交, 测定其杂种优势及杂种表现。16份新恢复系中除931和帐23外, 其余的14份新恢复系与2个不育系的遗传距离均大于其春性亲本恢复系与相应不育系的遗传距离, 说明导入半冬性品种遗传成分能扩大春性恢复系与不育系间的遗传差异; 配制的26个杂交组合中, 其双亲中不育系所对应保持系单株产量为高亲值的组合有15个, 其中13个组合单株产量超亲优势都强于所对应不育系与亲本恢复系Ag-5所配杂交组合, 说明导入半冬性品种遗传成分可增强甘蓝型春油菜杂种优势; 12个新恢复系分别与2个不育系所配24个组合中18个组合的单株产量都分别超过所对应不育系与亲本恢复系Ag-5所配杂交组合, 说明导入半冬性品种遗传成分能提高甘蓝型春油菜杂种的产量; 新恢复系与2个不育系杂交后代的抗病性均强于其亲本恢复系与相应不育系杂交后代的抗病性, 说明导入半冬性品种遗传成分能提高春性甘蓝型油菜杂交种抗菌核病的能力。研究结果表明, 半冬性甘蓝型油菜品种可能为春油菜杂交育种提供有价值的遗传资源。