猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒ORF5基因的克隆与表达

用RT-PCR方法从河南分离的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)变异株(HN07-1)中扩增ORF5全长基因,将其克隆至pMD19-T载体。测序结果表明,该序列与标准美洲株VR-2332同源性为89%,与我国早期分离的BJ-4株同源性为88%,与HB-1、JXAI变异株同源性为96%和99%。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-Blot结果表明,成功表达了41.5 kD的融合蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NX-1株ORF5,ORF7基因的克隆

为了从分子水平了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5和ORF7基因的特征,并为PRRSV的遗传进化和分子变异研究提供资料。对宁夏地区流行的PRRSV进行采样分析,运用RT-PCR技术分别扩增了PRRSV NX-1/2008毒株囊膜蛋白基因ORF5与衣壳蛋白基因ORF7,并对其进行了克隆,随后利用DNAS-TAR生物软件进行了同源性比对和进化分析。结果显示,PRRSV NX-1/2008毒株的ORF5,ORF7基因均与JXa-1/2007等高致病性毒株高度同源,ORF7的氨基酸同源性则达到了100%。与空间距离较远的JXa-1/2007毒株相比,NX-1株的ORF5基因在中和抗体决定区196位上发生突变,而与相距较近的HUB-1/2006,CH-1 a/2001等毒株相比较,则无此突变;与CH-1 a/2001毒株相比,GP5蛋白的免疫原性核心位点B 39位的F→I,在诱导中和抗体起重要作用的33位糖基化位点N→S,同时,诱骗位点A(30~38氨基酸)的32,33和35位氨基酸都发生了突变。NX-1株的ORF7基因与国内CH-1 a/2001等低致病性毒株间的突变有69%位于抗原决定区,而其中有56%是高致病性毒株的主动突变。研究表明,分离的PRRSV高致病性毒株与低致病性毒株的抗原性在基因组上有较大范围的变异,且这种变异可能还主要位于免疫决定区。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析

以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）YA株为材料，采用RT－PCR扩增其ORF5基因全长cDNA并进行序列测定和比较分析。结果YA株ORF5基因cDNA编码区长603bp，可编码200个氨基酸残基。与欧洲型代表株LV株、美洲型代表株VR－2332株在氨基酸水平上的同尖性分别为58％和90％，与国内首株分离株(CH－1a)的同源性高达95％，推测YA株属于美洲型。根据YA株ORF5基因编码的氨基酸序列，与具有代表性的12株美洲型毒株和2株欧洲型毒株绘制进化系统树，结果也显示YA株与美洲型分离毒株的遗传关系较近，而与欧洲毒株的遗传关系较远。进一步采用序列分析软件对推导的氨基酸进行比较分析，发现YA株ORF5编码的E蛋白存在5个潜在的N－糖基化位点，6个抗原位点，其糖基化位点的数目及抗原位点的分布与其它美洲毒株均存在一定程度的差异，但3个最主要的抗原表位相对保守。     

猪繁殖与呼吸综合征流行株ORF5基因遗传变异分析

[目的]分析猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）发病原因、流行趋势,为预防和控制PRRSV提供理论依据。[方法]根据GenBank上的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332的全基因序列,设计并合成引物,采用RT—PCR技术扩增了7株流行株（HIJ10,HL148,HLJ64,HLJ76,HL177,HLJ85,HLJ87）中的ORF5基因序列。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCCVR-2332、CH-1a、BJ-4、LV及疫苗株MLV进行序列比较。同时用系统进化树分析了分离株之间的亲缘关系。[结果]核苷酸序列分析表明这7株流行株中ORF5基因与VR-2332、CH—1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88．1％～98．8％,89．9％～95．2％,85．6％～98．7％;与LV的同源性为54．7％～56．9％。氨基酸序列分析表明这7株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ4等代表株的同源性分别为88．1％～96．8％,88．1％～94．5％,86．1％～96．5％;与LV的同源性为54．7％～56．2％。通过系统发育进化树分析可知HLJ48、HL164、HLU6、HLJ77、HLJ85与CH-1株亲缘关系密切,同属一亚群,表明所获得的毒株与参考株CH．1亲缘关系较近,可能由CH-1演化而来。HLJ10、HU87与疫苗株MLV关系较近,而且HLJ10、HLJ87的同源性高达100％,可能由于使用疫苗而感染,说明黑龙江省存在疫苗毒的隐性感染。[结论]流行株在ORF,基因区域的变异较大,同一地域分离株间ORF,基因序列同源性较高且亲缘关系较近,不同地域则较远。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒新疆株ORF3基因的克隆与测序

根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因序列,设计合成了1对特异性引物,扩增出病毒ORF3结构基因。将该基因克隆到pMD18-T,构建了重组质粒pMD18-ORF3,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的ORF3基因组全长812 bp。通过DNAman对所测ORF3基因核苷酸序列与GenBank中登录的国内外PRRSV毒株核苷酸序列进行同源性比较。序列分析结果显示,XJPRRSV1/03与参考毒株VR2332、LV、CH-1a的核苷酸同源性分别为95.8%,89.8%,92.7%,氨基酸同源性分别为96.6%,88.5%,93.2%。XJPRRSV1/03与VR2332同源性最高。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆、表达与免疫印迹

将猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因克隆入原核表达载体pET-28a( )的多克隆位点中,经鉴定后得到重组质粒pET-ORF5,将此重组质粒分别转化到受体菌E. coli BL21(DE3)中,并用诱导剂IPTG进行诱导表达,2 h后表达达到高峰.经15%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的蛋白大小约为13.75 kD.经Western Blotting分析,表达蛋白能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应,具有较好的免疫原性,为研究PRRSV亚单位疫苗奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析

采用RT—PCR方法对疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序获得了0RF7基因片段。序列分析结果表明获得的0RF7基因序列不存在缺失现象。与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列的同源性为91．3％,氨基酸同源性为92．6％;与我国最早的PRRSV分离株CH—la相比,核苷酸同源性为93．5％,氨基酸同源性为92．6％;与我国高致病性PRRSV毒株SD—ZQ的核苷酸同源性最高为98．1％,氨基酸只有两个不同,同源性为98．3％;与本省的Hn-1／06毒株的核苷酸同源性为97．3％,氨基酸同源性为97．5％;与2004年分离的FJ-2株与ORF7基因的核苷酸差异稍大为85．4％,氨基酸同源性为88．6％;与欧洲型分离株LV株和N-34株0RF7基因的核苷酸差异很大,同源性仅为41．1％和40％,氨基酸同源性为47．1％和47．6％。表明所获得序列的流行毒株属于美洲型,但其毒力已发生了变异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2株ORF7基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]对猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2毒株核蛋白编码基因ORF7进行研究,为进一步了解其编码蛋白的功能和研制新的血清学诊断方法奠定基础。[方法]采用RT—PCR方法扩增HBKM2株的DR胛基因,然后利用DNAStar软件包对克隆的序列进行序列分析,将ORF7基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX—KG上,构建重组表达质粒pKG—N。将重组质粒转化到大肠杆菌B121。并经IPTG诱导表达,最后利用Western-blot对表达蛋白的免疫反应活性进行鉴定。[结果]HBKM2毒株的0R刀基因长约372bp;序列分析表明与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的同源性达99％以上;SDS—PAGE表明克隆的0R几基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达：Western-blot分析表明,重组蛋白GST—N能够与PRRSV高免猪血清发生特异性的免疫反应。[结论]成功地扩增了ORF7基因。且GST-N融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒兰州分离株ORF3基因的克隆及杆状病毒载体的构建

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF3序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃Lanzhou株的ORF3基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF3,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF3转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF3.成功构建了PRRSV Lanzhou株ORF3基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析

[目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG在最适条件下诱导表达,其表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行检测。应用Ni-NTAHis.Bind Resin层析柱在变性条件下纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。采用Western Blot及间接ELISA法检测复性后重组蛋白的免疫学活性。[结果]重组质粒pET-ORF7在大肠杆菌中以融合形式成功表达,融合表达产物主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE检测所表达的重组蛋白分子量为33 kD左右,与预期大小相符。Band-scan软件对表达蛋白分析发现,表达产物约占菌体蛋白的50%。Western Blot及间接ELISA法显示复性后的重组蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应,表明其具有良好的免疫学活性。[结论]该试验将为进一步研制PRRSV单克隆抗体及诊断试剂盒奠定基础。     

猪CD40L基因的原核表达及特异性多克隆抗体制备

从猪外周血淋巴细胞中克隆猪CD40L基因,构建表达载体pET-CD40L,转化大肠杆菌BL21(DE),表达获得相对分子质量约为48x103的重组融合蛋白.以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,获得抗猪CD40L的特异性抗体.间接ELISA检测到多克隆抗体效价达到1:12 800,Western-blot检测结果表明,得到的抗体既可与纯化的CD40L蛋白特异性结合,又可与表达猪CD40L的重组杆状病毒特异性结合.     

中华蜜蜂王浆抗菌肽Acc-royalisin基因原核表达及多克隆抗体制备

以含中华蜜蜂王浆抗菌肽Acc-royalisin基因的该蜂头部cDNA文库质粒为模板,用PCR方法扩增出其前体片段,并克隆入表达载体pGEX-4T-2中,在大肠杆菌BL21中与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合进行表达,得到大小为36ku,占细胞总蛋白16.3%,与GST多克隆抗体有免疫反应的表达产物;用割胶回收获得的目的蛋白注射新西兰大白兔,采集血清制备多克隆抗体,该抗体与纯化的GST-Acc-royalisin融合蛋白经ELISA反应显示出较高效价,经Westernblot印迹分析获得特异性条带.这为进一步利用免疫方法检测王浆的防腐性能和Acc-royalisin生物制品质量,以及蜜蜂抗病性奠定了基础.     

水牛Tle6基因表达模式分析及其多克隆抗体制备

【目的】明确水牛Tle6基因表达组织特异性及其在卵母细胞和早期胚胎中的表达模式,并通过构建原核表达载体诱导表达融合蛋白及免疫小鼠制备TLE6多克隆抗体,为进一步揭示Tle6基因在水牛生殖发育中的作用机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR扩增水牛Tle6基因编码区（CDS）序列,经生物信息学分析后,分别以半定量PCR和实时荧光定量PCR检测分析水牛Tle6基因表达组织特异性及其在卵母细胞和早期胚胎中的表达模式。构建重组原核表达载体,以IPTG诱导表达的融合蛋白免疫小鼠制备TLE6多克隆抗体,再利用TLE6多克隆抗体检验TLE6蛋白在水牛不同组织及卵母细胞和早期胚胎中的表达情况。【结果】水牛Tle6基因CDS序列全长1731 bp,编码576个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为64.09 kD,理论等电点（pI）为5.69,属于亲水性蛋白。Tle6基因仅在水牛的卵母细胞中特异性表达。重组原核表达载体p ET-32a-Tle6转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导6 h,融合蛋白TLE6的表达量最高,且以可溶性蛋白和包涵体2种形式进行表达;以纯化的融合蛋白TLE6免疫小鼠成功制备获得TLE6多克隆抗体,其抗体效价为1∶64000,能与融合蛋白TLE6及水牛卵母细胞发生特异性反应,即具有很强的特异性。【结论】Tle6基因仅在水牛卵母细胞中特异性表达,而在其他组织中未见表达。不同于其他MEGs的表达模式,Tle6基因在水牛卵母细胞及胚胎早期发育过程中呈特异性持续表达,可能在水牛卵母细胞成熟及附植前的胚胎发育过程中发挥重要作用。     

鳗鲡疱疹病毒ORF51基因的原核表达及多克隆抗体的制备

将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.     

嗜水气单胞菌气溶素的原核表达及其多克隆抗血清的制备

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气溶素(aerolysin,Aer)基因的序列设计引物,以来自湖北的鱼源A.hydrophila分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,A.hydrophila的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a(+)载体构建Ah15株aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2ku相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。浓缩后的包涵体蛋白免疫新西兰大白兔获得了重组蛋白的抗血清,Western blot结果显示,兔抗血清可以识别A.hydrophila的重组毒素,说明该基因的重组蛋白具有很好的免疫原性,可作为A.hydrophila基因工程疫苗研制的候选基因。     

PEDV CH-HeB14株S1蛋白表达及其多克隆抗体的制备

【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH-HeB14毒株S1蛋白的多克隆抗体,为PEDV新流行毒株诊断试剂盒和疫苗研制提供基础材料。【方法】利用RT-PCR扩增PEDV CH-HeB14毒株S1基因,对序列特征进行生物信息学分析,用PCR将S1基因截成不同片段(S1A、S1B、S1C、S1C-1和S1C-2),分别克隆至原核表达载体pET28a,转化BL21(DE3)构建重组表达菌株;用IPTG诱导重组蛋白表达,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。将表达蛋白与佐剂乳化制备免疫原免疫兔多克隆抗体,Western blotting和免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性。【结果】PEDVS1、S1A、S1B、S1C、S1C-1和S1C-2片段长度依次为2 079,600,600,878,549和447bp。系统进化树表明,CH-HeB14株与2010年以来的22个新流行毒株亲缘关系较近,而与经典疫苗株CV777、attenuated DR13亲缘关系较远。成功截短表达了S1蛋白不同区段S1A、S1B和S1C-1重组蛋白(rS1A、rS1B和rS1C-1),且蛋白均以包涵体形式表达。制备了抗rS1A、rS1B和rS1C-1蛋白的多克隆抗体,其与这3种蛋白反应良好,且抗rS1A重组蛋白的多克隆抗体Western blotting效价为1∶32 000;IPMA结果显示,该抗体能与PEDV CHHeB14毒株和经典疫苗毒株attenuated DR13均发生特异性反应。【结论】成功克隆、表达了变异毒株PEDV CHHeB14的S1基因,所制备的S1蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性。     

PRRSV河南株ORF7基因的克隆表达及条件优化

从猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)河南分离株(HN07-1、HN07-2)的细胞培养物中提取RNA,根据参考株IAF-exp91 N蛋白基因序列设计出2对引物,成功克隆出ORF7全长基因,并连接至pMD-19T栽体.基因测序结果表明,2株PRRSV河南分离株ORF7基因序列完全相同;该序列与HB-4(hs)同源性为...     

鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的表达

构建鸡γ-干扰素基因(lFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达。根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用prim er5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序。测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列同源性为100%。将序列连接到原核表达载体pET28 a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明鸡γ-干扰素表达蛋白大小为20.8KD,并以包涵体形式表达。为鸡γ-干扰素生物制剂或疫苗佐剂的开发奠定基础。     

鸡白细胞介素2原核表达及多克隆抗体的制备

鸡白细胞介素2(IL-2)是一种在机体免疫调节中具有多种功能的细胞因子.本研究将萧山鸡白细胞介素2基因克隆入原核表达载体pET-28b,获得了重组表达载体pET-28b-IL-2,将此重组表达载体转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达萧山鸡IL-2.SDS-PAGE结果表明,萧山鸡IL-2在大肠杆菌中得到了表达,以此表达产物制成油乳剂苗免疫家兔,用ELISA和Western blotting检测兔血中的多克隆抗体,结果均为阳性.因而为进一步开展鸡IL-2的结构和功能研究奠定了基础.