水稻与白叶枯病菌互作的基因表达谱分析与差异性表达基因的识别

【目的】从基因组水平上阐明水稻在与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo)感病互作条件下基因表达反应的特征。【方法】用cDNA-AFLP方法对Xoo接种处理不同时间的水稻细胞进行基因表达谱分析。【结果】在测定的大约4 000个水稻cDNA片段中，363个(9.1%)是差异性表达的，其中295个受Xoo诱导上调表达，68个被抑制下调表达。根据在不同互作时间点的表达特征，它们可分为7种表达类型。对31个差异片段的序列同源性进行分析，发现它们在己公布的水稻全基因组中完全相同的序列，但只有10个基因具有已知或推断的生物学功能，其余21个基因功能未知。用荧光实时定量PCR分析法证实了cDNA-AFLP基因表达结果。【结论】构建了水稻－Xoo感病组合在细胞水平上互作的基因表达谱，从基因组水平上识别了一批受Xoo诱导或抑制表达、与水稻感病反应相关的基因，这些新基因的发现为开展水稻感病功能基因组学的研究提供了材料。     

水稻白叶枯病菌的胞外酶与毒力关系的初步研究

研究了水稻白叶枯病菌60个菌株所产生的胞外蛋白酶、纤维素酶(Cx)和果胶酶的活力及其产生胞外粘多糖的能力。从总体看,蛋白酶活力与菌株毒力成正相关,而纤维素酶活力与菌株毒力相关不显著。但来自华南地区的一些菌株的毒力与纤维素酶活力显著相关,而与蛋白酶没有显著的相关性。蛋白酶和纤维素酶的产生都受培养基中氮源成分的影响。尚未发现果胶酶活力及粘多糖产生能力与毒力有任何关系。     

4种微量元素对水稻白叶枯病菌生长的影响

设计０、０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０ｍｍｏｌ／Ｌ７种浓度,研究了Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｂ４种微量元素对水稻白叶枯病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏ－ｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｘａｅ,简称（Ｘｏｏ）生长的影响,结果表明：不同微量元素在不同浓度对Ｘｏｏ生长具有不同的影响效果。Ｃｕ抑制效果最强,在０．１ｍｍｏｌ／Ｌ时即有较强的抑制作用。５ｍｍｏｌ／Ｌ时完全抑制Ｘｏ的生长;其次为Ｆｅ、在０．１和１ｍｍｏｌ／Ｌ时,只对Ｘｏ的生长后期有抑制作用,对生长初期有些刺激作用,但到５ｍｍｏｌ／Ｌ时则有很好的抑制效果;再次为Ｚｎ,在１和５ｍｍｏｌ／Ｌ时,只对Ｘｏ的生长初期略有抑制作用,对生长后期有些刺激作用,高达１０ｍｍｏｌ／Ｌ时才表现明显的抑制作用;Ｂ在低浓度时对Ｘｏ的生长无影响,而在５和１０ｍｍｏｌ／Ｌ时则表现为刺激作用。     

水稻白叶枯病菌致病型的聚类分析

全国各病区筛选出的１９个代表菌株在我国，日本和ＩＲＲＩ的三套鉴别寄主上的反应，应用系统聚类法能有效地划分出水稻白叶枯病菌致病力极强，强，中强，中弱，弱和极弱６群。该法无需人为制定一个抗感标准，能额观反映病菌的致病类群。     

水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌在不同培养基上的回收率测定

选用523培养基(523)、营养培养基(NA)和改良胁元培养基(WF—P)对水稻白叶枯病菌(B—3)和条斑病菌(A—1)的回收率测定结果表明,病原菌的回收率范围为12.3%～76.6%,其中A～1的平均回收率较高,达61.5%.B—3的平均回收率很低,仅为26.3%.同一菌株在不同培养基上的回收率亦存在明显差异,A—1在NA上的回收效果最佳,回收率达75.9%.在523和WF—P上较差;WF—P对B—3的回收率亦达46.1%,几乎是523和NA培养基的3倍.WF—P和NA可分别作为检测水稻白叶枯病菌和条斑病菌的基础培养基.     

云南省水稻白叶枯病菌致病力差异的地理分布

使用12个分别持有不同抗病基因（Xa1,Xa2,Xa3,Xa4,Xa5,Xa7,Xa8,Xa10,Xa11,Xa13,Xa14和Xa21）的近等基因系水稻白叶枯病鉴别品种及3个对照品种（IR24，Toyonishiki和Sigadagabo），鉴别了从云南省收集的138个菌株。结果根据致病谱可以将这些菌株分成A－J共10组。A组菌株仅对Toyonishiki和Sigadagabo两个对照品种致病，J组菌株则能对9个鉴别品种和3个对照品种致病。对不同海拔采集的菌株进行致病力分析的结果表明，从大理、武定等较高海拔粳稻种植区采集的菌株致病力较弱，在鉴别品种上病斑的平均长度不到50mm；而元江、景洪、潞西等低海拔杂交稻种植区采集的菌株致病力较强，在鉴别品种上的病斑平均长度超过100mm。从高海拔稻区到低海拔稻区，病菌致病力有逐步增强的趋势。     

水稻黄单胞细菌的无毒基因

水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种与水稻品种的互作关系符合基因一基因假说。病菌无毒基因(A)与寄主抗病基因(R)显性互作表现抗性反应。许多黄单胞细菌的无毒基因属于avrBs3／pth家族。已报道的avrxa5、avrXa7、avrXa10以及本实验室从水稻白叶枯病菌菌株JXOⅢ克隆的avrXa3均属于avrBs3／pth家族。最近的研究还发现，PR6菌株中有2个硫同化基因簇成员raxP和raxQ对决定avrXa21活性是必需的。笔在研究无毒基因avrXa3时，从JXOⅢ的基因组库克隆中发现一个与甘蓝黑腐黄单胞菌烯醇化酶一磷酸酶基因的同源序列也具有无毒基因活性。在介绍黄单胞细菌无毒基因类群和avrBs3／pth家族基因结构与功能的同时，结合本实验室的研究结果着重对水稻白叶枯病菌无毒基因的研究进展进行综述。     

水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因的敲除

wxocA、wxocB、wxocD、wxocE和wzt是水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzicola,Xooc）的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）合成基因,avrXa3是水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzae,Xoo）的一个无毒基因。利用pBCSK（-）和pKNG101两个质粒的复制起点不被水稻黄单胞菌识别的特点,把wxocA、wxoeD、wxocE和wzt的中心区域克隆在pBCSK（-）上,获得突变转化单元pBCSK：：ΔwxocA、pBCSK：：hwxocD、pBCSK：：AwxocE和pBCSK：：Δwzt。把wxocB和avrXa3基因的旁侧序列和一个氯霉素抗性基因cm构建在pKNG101上,获得突变转化单元pKNG101：：ΔwxocB和pKNG101：：Δavr。以电转化方式把这些LPS合成基因突变转化单元DNA转入Xooc菌株RS105,把无毒基因突变转化单元转入Xoo菌株PXO99,通过同源重组分别获得了RS105中5个如相应基因突变体MwxocA、MwxocB、MwxocD、MwxocE、Mwzt和一个无毒基因的突变体PX099Δavr。SDS-PAGE分析发现,lps突变体的O抗原或核心寡糖的合成被破坏。致病性分析结果显示,基因wxocB、woxocE和wzt与致病性有关,前两基因的突变导致细菌完全失去毒性,而后一基因的突变导致细菌部分丧失毒性。与PX099相比无毒基因突变体PX099Δavr改变了原有的毒性表型,在IRBB50（Xa4／xa5）和Asominori（Xa17）上由较感转变为较抗表型。因此,本试验证明,以pBCSK（-）和pKNG101为载体敲除水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因是可行的。     

水稻白叶枯病菌解毒素蛋白提纯和作用机制研究

采用 (NH4) 2 SO4分步沉淀法 ,从水稻白叶枯病菌培养滤液中提取对水稻白叶枯病菌有机酸毒素具解毒作用的解毒蛋白粗提物 (crudedetoxificationprotein ,CDP) ,经滚动式等电聚焦电泳 (RPIE)和离子交换层析 (FPLC)分离 ,生物测定结果表明 ,第Ⅱ吸收峰具有生物活性 ;再经SDS PAGE电泳和考马斯亮蓝染色 ,第Ⅱ吸收峰收集物有明显的一条带 ,相对分子质量为 4 7 9× 10 3 。野生菌产生的CDP解毒活性明显低于其毒性基因突变体。CDP对热和蛋白酶K均不稳定 ,对毒素的解毒主要是通过脱羧起作用。用CDP处理水稻后 ,水稻体内与抗病性相关的酶活性显著提高 ;接种水稻白叶枯病菌 ,病斑长度明显降低     

疣粒野生稻抗白叶枯病新基因xa32(t)的鉴定及其分子标记定位

xa32（t）是从疣粒野生稻与栽培稻经体细胞杂交途径获得的新种质Y76中鉴定出的水稻抗白叶枯病新基因。将Y76与栽培稻＂大粒香＂回交构建F2群体,获得132个抗性稳定的株系。经致病菌株P6对该F2群体抗性鉴定,得到抗感株系数分别为32和100。随机选用覆盖水稻12条染色体的412对SSR引物对亲本和F2代群体进行多态性分析。筛选出8对多态性好的引物标记,连锁遗传分析发现位于xa32（t）同侧的RM8216和RM20A与其连锁,从而将xa32（t）定位在第12染色体长臂上,遗传距离为6.9cm和1.7cm。     

疣粒野生稻抗白叶枯病新基因xa32(t)的鉴定及其分子标记定位

xa32(t)是从疣粒野生稻与栽培稻经体细胞杂交途径获得的新种质Y76中鉴定出的水稻抗白叶枯病新基因。将Y76与栽培稻"大粒香"回交构建F2群体,获得132个抗性稳定的株系。经致病菌株P6对该F2群体抗性鉴定,得到抗感株系数分别为32和100。随机选用覆盖水稻12条染色体的412对SSR引物对亲本和F2代群体进行多态性分析。筛选出8对多态性好的引物标记,连锁遗传分析发现位于xa32(t)同侧的RM8216和RM20A与其连锁,从而将xa32(t)定位在第12染色体长臂上,遗传距离为6.9cm和1.7cm。     

水稻白叶枯病菌hrpF启动子序列调控的绿色荧光蛋白基因表达体系的构建

为了阐明启动子序列对水稻白叶枯病菌效应子基因表达的调控作用及特征,通过融合PCR将报告基因GFP基因置于水稻白叶枯病菌hrpF基因启动子序列的下游,经酶切、PCR鉴定及序列测定,成功构建了受hrpF启动子序列调控的GFP基因转录单元pMF-GFP,并转入JXO I菌株中。结果发现构建的hrpF：：GFP转录单元,在hrp诱导培养基XOM2上可有效诱导表达,而在NA培养基上不能诱导表达。结果还显示,在大肠杆菌中,中间表达载体phrpF：：GFP具有GFP表达活性。     

东北水稻白叶枯病菌株遗传多样性分析及品种对白叶枯病抗性评价

水稻白叶枯病最近几年在中国东北地区呈现突发和爆发态势。明确当地病原菌毒性和品种抗病情况,是防治白叶枯病的有效措施。选择东北稻区23个水稻白叶枯病菌菌株,进行了IS-PCR扩增和系统分析,结果显示:在0.83遗传距离水平,23个菌株可划分为5个簇。利用分离的水稻白叶枯病菌株与粳稻品种接种互作,"通禾855"等部分品种表现较强抗谱。用9个中国水稻白叶枯病菌标准菌株对15份北方粳稻品种进行人工接种,结果显示除品种"通系929"表现中抗外,其他品种的抗性综合表现感病。研究结果表明:北方水稻白叶枯病菌遗传多样性较复杂,筛选、引进广谱抗水稻白叶枯病种质资源材料非常必要,而且,利用当地菌株筛选抗源材料更加可靠。     

水稻细菌性条斑病菌和白叶枯病菌的多重PCR检测体系开发

本研究设计水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌的专化性引物,建立了可同时检测这两种细菌的多重PCR检测体系。通过体系优化、特异性和灵敏度检查,结果表明：两对专化性引物X-b和X-t具有较高的特异性和灵敏度,对水稻细菌性条斑病菌液和水稻白叶枯病菌液的检测灵敏度分别为104 cfu/mL和105 cfu/mL;利用本研究建立的多重PCR体系,成功地从50种市售水稻种子中检测出1个水稻品种带有水稻细菌性条斑病菌,1个水稻品种水稻白叶枯病菌。本研究建立了多重PCR检测体系,为检疫部门控制这两种检疫性种传病害的入侵提供了有效检测技术和手段。     

云南水稻白叶枯菌的RAPD分析

选取云南水稻白叶枯病菌优势小种的代表菌株41个,利用从258个RAPD随机引物中筛选出多态性好的24条引物对其DNA进行多态性分析.指纹图谱和聚类分析结果表明,各优势小种间遗传差异较大,菌株间具有明显的遗传多态性,在不同的相似水平下可分为不同的遗传组群.水稻白叶枯病菌优势小种间在分子水平上存在明显差异,且遗传组群与小种间有对应关系,遗传距离为0.2时可以将41个水稻白叶枯代表菌株分为10个遗传相似组,其中第2、8、10组为主要组群,第2组包括14个菌株,主要为7号小种;第8组有9个菌株,全部为8号小种.     

病程相关蛋白质在水稻与白叶枯病菌互作过程中的表达

【目的】了解病程相关(pathogenesis-related,PR)蛋白质在植物防卫体系中的表达模式进而探讨水稻抗病的分子机理。【方法】选取10个前期工作中鉴定的差异转录PR基因,利用免疫印迹(Western blotting,WB)技术检测它们在水稻正常生长和与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae Xoo)互作过程中的表达丰度变化。【结果】发现随着水稻的生长,Os12g43380、Os12g36830、Os12g36860、Os12g36840、Os02g41670、Os05g35290和Os12g33610的表达逐步增加,一般在开花期达到最高,成熟期有所降低。在白叶枯病抗性基因Xa21介导的水稻-Xoo非亲和互作过程中,检测到Os01g51570、Os01g71680和Os12g36850的表达量上调,Os12g36830、Os12g36840、Os02g41670和Os05g35290的表达量下调,并且发现,在亲和互作和非亲和互作反应中PR蛋白质的变化模式相似。对PR基因上游启动子区进行分析,发现存在与抗病相关的顺式作用元件,其中,ARE、HSE、MBS、TC-rich repeats等元件在抗病相关的PR基因上游出现频率较高。【结论】鉴定了在水稻-Xoo互作过程中发生丰度变化的7个PR蛋白质。