谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)对逆境胁迫的响应

为解析谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,Phosphoenolpyruvate carboxylase)在非生物逆境胁迫下的响应特征。从谷子基因组中鉴定出一个Si PEPC(Seita. 1G020700)基因,利用相关软件对其氨基酸序列、蛋白特征、功能、信号途径、顺势应答元件等参数特征进行分析和预测,随后分析了该基因在幼苗期逆境胁迫下的动态表达模式及在拔节期、抽穗期、灌浆期不同光照处理和干旱胁迫下的表达。结果表明,该基因位于谷子1号染色体,基因组序列长6 652 bp,编码965个氨基酸,基因无可变剪切、不含内含子;功能域分析显示,该基因含PEPC基因的特征结构域;多序列比对发现,该PEPC蛋白与其他植物PEPC蛋白非常相似,具有非常保守的序列结构。实时荧光定量PCR分析表明,Si PEPC(Seita. 1G020700)在ABA、低温、PEG、高盐胁迫下表达量均有所上调,其中,在ABA处理时,表达量呈现波动,在12 h被诱导达到峰值。在低温处理时,表达量持续上升,在24 h达到峰值;在PEG和Na Cl处理时表达量整体呈上升趋势,均在12 h达到峰值,在24 h其表达量均急剧下降。进一步研究表明,Si PEPC基因在拔节期和抽穗期正常光照强度下参与了对干旱胁迫的响应,推测Si PEPC(Seita. 1G020700)基因参与了谷子对非生物逆境的应答,可能在干旱和其他逆境胁迫信号途径中起关键作用。     

谷子LEA＿1基因家族鉴定及其渗透胁迫响应

胚胎发育晚期丰富(late embryogenesis abundant,LEA)蛋白在植物响应多种非生物胁迫过程中具有重要作用。基于表达谱测序数据我们分析了抗旱谷子品种(GG)和干旱敏感品种(JF)在PEG胁迫0.5 h前后LEA基因的表达变化,发现谷子LEA_1家族的Seita.6G114000基因在抗旱性不同的谷子品种中胁迫响应模式不同;利用同源序列比对和保守结构域分析我们系统鉴定得到5个谷子LEA_1家族蛋白(PF03760),该家族基因序列短,启动子区皆含多个ABRE元件,蛋白质N端序列高度保守;通过分析NCBI数据库中谷子转录组测序数据(SRA062640),发现谷子LEA_1家族基因在‘豫谷1号’中PEG胁迫7 h前后转录本丰度变化显著,表明LEA_1家族蛋白在谷子应对干旱胁迫过程中发挥重要作用。上述结果为深入研究LEA_1基因在逆境应答中的功能提供参考。     

一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析

F-box是Skp1-Cullin1-F-box (SCF)型泛素连接酶E3的重要组成部分,在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆到与耐旱早期响应相关的F-box基因,命名SiFBX (GenBank登录号为KC252635.1)。该基因全长510 bp,编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明,该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸,缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明,该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb序列处,预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR分析表明,该基因分别在正常干旱、PEG和ABA诱导下,表达量出现显著变化。     

茶树中性/碱性转化酶基因CsINV10的克隆与表达分析

基于课题组前期对茶树冷驯化系统的转录组测序分析结果,从中挑选出6条与中性/碱性转化酶基因高度相似的EST序列,电子拼接和RT-PCR验证后获得一条全长为2101 bp的核酸序列。该基因包含1923 bp的ORF,编码640个氨基酸,蛋白分子量为71. 8 kD,理论等电点（pI）为5.69。根据BlastX同源性比对显示该基因与荔枝LcNI相似性最高（80%）,为G100家族成员,属于中性/碱性转化酶基因,将其命名为CsINV10（GenBank登录号为KT359348）。对CsINV10氨基酸序列的系统进化树分析显示,其与木薯MeNINV8亲缘关系最近。进一步分析显示,CsINV10的氨基酸序列无N端信号肽,无跨膜结构域,属于亲水性蛋白,并定位在叶绿体上。荧光定量PCR分析表明,CsINV10具有组织表达特异性,在茶树叶和花中的表达量最高,根系中最低。分析发现,低温（4℃）、干旱和盐胁迫分别处理茶树1 d后,成熟叶片中CsINV10的表达呈逐渐上升趋势;而在ABA条件处理下,该基因呈先升高后降低趋势,在处理5 d后基本不表达,表明该基因可能参与茶树对多种逆境胁迫的响应,这为后续进一步研究转化酶基因在茶树抗寒等逆境胁迫中的作用奠定基础。     

甘蔗ScHAK10基因克隆及表达分析

为探究甘蔗HAK基因家族中ScHAK10基因的功能及干旱环境下的响应机制,利用同源克隆技术（homologous cloning）从新台糖22号中克隆得到ScHAK10基因的完整编码序列,并对其进行生物信息学分析,同时采用q-PCR技术分析基因在不同组织以及在不同干旱阶段的表达情况。结果表明,ScHAK10基因编码区全长为2 433bp,编码810个氨基酸,相对分子量89.83kD,等电点（pI）为8.46,预测其为疏水碱性蛋白;核苷酸同源性分析表明ScHAK10基因与玉米（Zea mays L.）、高粱[Sorghum bicolor （L.） Moench]等其他作物中HAK基因具有高度的同源性;该蛋白具有跨膜结构域,定位在细胞质膜上。蛋白质二级结构分析发现其主要由α螺旋（38.15%）、扩展长链（19.26%）和无规则卷曲（37.16%）组成;蛋白功能预测显示其与阳离子运输通道相关,有较大的概率显示其介入转录、信号传导、免疫应答等生物活动。qPCR表达分析显示,ScHAK10基因在不同部位都有表达,叶片中的表达量最高,其次为茎,根系中的表达量最低。干旱胁迫下ScHAK10基因受到诱导表达,表达水平根据胁迫程度的加深而呈现出先上调后下降的表达趋势,复水后,基因表达量降低。本研究为进一步阐明甘蔗ScHAK10基因的功能及甘蔗耐旱调控相关分子机制奠定了基础。     

谷子WRKY转录因子对白发病菌胁迫的响应

谷子白发病是谷子生产上的重要病害,可严重影响谷子的产量和品质。WRKY转录因子广泛参与植物的抗病,生长发育等多种生理过程。为了探究谷子WRKY转录因子对白发病菌胁迫的响应,进而发掘谷子特有的抗病基因并为以后的抗病研究提供参考,本研究以感病品种‘晋谷21’为试材,基于前期对转录组测序的基础上,筛选出8个与谷子白发病相关的WRKY转录因子基因,然后通过生物信息学技术,对这8个WRKY转录因子基因特征,基因序列及所在染色体位置,基因组结构模式启动子序列元件,与白发病菌相关的调控元件以及表达模式等进行了分析。研究发现,8个WRKY转录因子基因中5个基因分布在5号染色体上,在受白发病菌胁迫后其表达水平存在显著差异。启动子顺式元件分析的组成和分布也存在较大差异,8个基因的蛋白大小是202~440个氨基酸,系统进化树分析表明,基因Seita.8G123100,Seita.5G261700的亲缘关系较近,并且受侵染后的表达水平均高于正常水平。发现8个基因中5个基因在受到病原菌侵染时其表达水平高于其正常状态下的基因表达水平,可以作为谷子抗病的重要候选基因。本研究结果为后续筛选谷子抗病基因及谷子抗病机制的研究奠定了一定的理论基础。     

非生物逆境胁迫下甘蔗CBL1和CBL6基因表达分析

CBLs蛋白是植物一类特殊的Ca2+信号感受器,在植物遭受逆境胁迫过程中发挥重要的调节作用。文章利用NCBI数据库信息获得2个甘蔗CBL家族基因,分别为SsCBL1和SsCBL6。SsCBL1基因包含一个完整的642 bp的完整开放阅读框,编码213个氨基酸;SsCBL6基因包含一个完整的672 bp完整开放阅读框,编码223个氨基酸。通过生物信息学分析方法对SsCBL1和SsCBL6基因编码蛋白结构进行分析。结果显示两者均无跨膜结构域并且都包含4个EF-hand结构域。进化树分析显示SsCBL1和SsCBL6与其他植物的CBL1和CBL6亲缘关系较近,具有较高的保守性。实时荧光定量PCR检测结果发现,这两个基因在低氮、低磷、低钾、干旱、盐和ABA胁迫过程中其表达均发生变化。SsCBL1基因在干旱和盐胁迫过程中,表达量上调幅度较大,而SsCBL6基因在低钾、干旱和盐处理时表达量上调幅度大。实时定量分析结果表明SsCBL1和SsCBL6基因在多种胁迫下发挥重要的调控作用。     

小麦细胞分裂素受体基因TaHK1的生物信息学及表达特性分析

细胞分裂素在植物发育和应对盐渍、干旱等非生物胁迫的过程中均扮演着重要的角色。为了研究小麦细胞分裂素受体基因的功能,利用已知的拟南芥细胞分裂素受体基因AHK4(At2g01830)为参考序列,使用同源克隆的方法从小麦基因组中得到同源性最高的基因TRIAE_CS42_4DS_TGACv1_362760_AA1181940(Ensembl Plants),命名为TaHK1。生物信息学分析表明,TaHK1位于小麦4D染色体上,编码的蛋白由996个氨基酸组成,分子质量为109. 70 ku,等电点为5. 71; TaHK1蛋白二级结构由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角4种构象组成;亚细胞定位预测该蛋白定位于细胞膜的可能性较大,跨膜结构域预测其具有2个跨膜域;蛋白保守结构域分析发现,TaHK1具有典型的细胞分裂素受体的完整结构域,并且含有87个磷酸化位点。表达谱分析显示,TaHK1在根、茎、叶、雄蕊和小穗等各个组织有广泛表达;此外,TaHK1表达量受低磷胁迫和多种病原菌侵染诱导,而受干旱胁迫抑制,推测其在小麦生长发育、抵御干旱胁迫和病原菌侵染过程中可能发挥重要作用。     

野生大豆胁迫应答膜联蛋白基因的克隆及胁迫耐性分析

野生大豆对非生物胁迫具有优良的抗性,是研究胁迫机制、挖掘抗性基因的理想材料。以耐盐野生大豆为试材,利用前期获得的盐胁迫基因芯片杂交结果和EST数据库,筛选出1个响应胁迫的3'-EST,序列分析表明,该EST编码膜联蛋白(annexin,ANN)。通过改进的5'-RACE获得了该基因的完整编码区,翻译产物与拟南芥膜联蛋白的相似性为57%,将该基因命名为GsANN。GsANN基因的翻译产物具有膜联蛋白家族特征性的结构域,无强烈的亲水/疏水性,无信号肽,无跨膜结构域,与已报道的植物ANN蛋白一致。亚细胞定位结果表明GsANN蛋白在细胞内聚集于质膜附近。GsANN基因在野生大豆叶中受盐及干旱胁迫的诱导,超量表达GsANN基因的拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的敏感性提高,揭示了该基因与植物抗性间的关系。     

3个水稻WAX2同源基因表达的组织特异性及逆境响应特征

利用拟南芥的WAX2基因序列BLAST检索出3个水稻同源基因,命名为OsWAX2-1、OsWAX2-2和OsWAX2-3,与拟南芥WAX2基因的同源性分别为56.0%、55.2%和52.0%;其预测的编码蛋白与WAX2蛋白的同源性分别为61.5%、60.5%和64.7%。这3个蛋白都分别存在4个跨膜结构区和1个甾醇去饱和酶的保守区,说明它们都属于跨膜蛋白并可能与角质层的蜡质合成有关。采用半定量RT-PCR方法检测3个OsWAX2基因在水稻不同部位的表达情况,及高温、低温、NaCl、PEG和ABA5种处理对3个OsWAX2基因在转录水平表达的影响。结果表明,3个OsWAX2基因在水稻中的表达存在时空差异,3个基因在水稻萌动的胚中表达量都很高,OsWAX2-3基因在叶中的表达量最高;3个OsWAX2基因对高温、低温、盐、干旱及ABA胁迫响应也存在差别,OsWAX2-1只在ABA处理时增强表达;OsWAX2-2受高温、低温、盐、干旱胁迫及ABA诱导并且响应迅速。这一结果为进一步研究OsWAX2基因在水稻生长发育过程及逆境胁迫下的功能与作用机制提供了参考。     

谷子花药颜色基因Siac1的精细定位

为从分子水平上揭示谷子花药颜色性状的遗传基础,以‘E1005’为母本,‘品资39号’为父本构建F2分离群体,利用集团分离分析法(BSA)结合隐性群体分析法(RCA),对谷子花药颜色基因Siac1进行精细定位。遗传分析表明,F2植株黄色花药与白色花药分离比例符合3:1的孟德尔分离规律,表明白色花药性状由一对隐性核基因控制。利用SSR和SV标记将Siac1初定位于第VI 染色体上标记GSA07025和GSA07037之间约282 kb的区间内。进一步利用根据亲本重测序结果新开发的InDel标记,最终将Siac1精细定位于标记MRI579和MRI583之间约94.7 kb区段内。生物信息学分析表明,该区间共有10个开放阅读框,初步推测Seita.6G227100、Seita.6G227200、Seita.6G227300和Seita.6G227900为花药颜色性状的候选基因。本研究为克隆Siac1基因、解析花药颜色发育机制奠定了一定基础。     

谷子CBL基因鉴定及其在干旱、高盐胁迫下的表达分析

CBL/CIPK信号网络系统在植物对逆境应答过程中起重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴定出7个候选CBL基因,命名为SiCBL1~SiCBL7。分析表明谷子CBL基因在蛋白质序列和结构上非常保守,所有预测SiCBL基因都含有7~8个内含子,而且其外显子序列同源性很高并且大部分外显子含有相同的碱基数目。预测SiCBL基因均含有4个EF-Hand功能域而且相邻EF-Hand功能域之间的氨基酸数目非常保守。进化和聚类分析结果表明, CBL基因在陆生植物早期的进化过程中就已经存在,所有CBL基因被分为4个亚组。7个候选SiCBL基因中, 4个基因(SiCBL1、SiCBL2、SiCBL3和SiCBL5)受干旱胁迫诱导表达,3个(SiCBL1、SiCBL3和SiCBL7)受高盐胁迫诱导表达。SiCBL3基因在干旱胁迫下被强烈诱导可能意味着其在干旱应答中起重要作用。本文报道的谷子CBL基因丰富和完善了植物CBL成员, 为进一步研究CBL/CIPK网络系统在抗逆作物谷子逆境响应中的功能、机制奠定了基础。     

谷子PP2C基因家族的特性

PP2Cs (2C type protein phosphatases)是一种单体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在真核生物中,PP2Cs在脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)等激素信号传导途径中起着重要的调控作用。本研究通过序列比对,从谷子基因组中筛选出80个PP2C候选基因,聚类分析将其分为12个亚族(A、B、C、D、E1、E2、F1、F2、G、H、I、J)。与拟南芥PP2C基因家族比对表明,A~I为2个物种共有的亚族,J亚族只存在于谷子基因组中,L亚族只存在于拟南芥中。将谷子A亚族的10个成员命名为SiPP2CA1-10。基因表达谱分析表明,A亚族基因不同程度受ABA、干旱、高盐、低温和低氮诱导表达,其中,SiPP2CA6、SiPP2CA8在5种处理下诱导表达量都高。对10个A亚族成员的启动子分析发现,在这些基因的启动子序列中含有多种参与逆境胁迫应答的顺式作用元件,其中,SiPP2CA5、SiPP2CA6、SiPP2CA7、SiPP2CA8的启动子中含有参与低氮胁迫响应的元件。进一步研究发现,SiPP2CA8主要在根部表达,且在低氮胁迫下一直有较高的表达水平。亚细胞定位结果显示SiPP2CA8定位在细胞膜、细胞质、细胞核中;双分子荧光互补试验(BiFC)结果表明,SiPP2CA8与一个ABA受体类似蛋白SiRCAR3(基因号Si018317m.g)在细胞膜、细胞质及细胞核上互作,表明SiPP2CA8在谷子中可能参与ABA信号传导过程。     

谷子F-box家族基因的鉴定、分类及干旱响应

蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动对维持植物正常生长发育和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性本研究根据谷子转录组分析结果从个家族成员中鉴定出个在干旱胁迫下表达量上调的基因根据序列相似性将其分为类同一类基因具有相似的内含子外显子结构染色体定位分析发现这些基因分别分布在谷子的条染色体上其中第条染色体上含基因最多有个。结构域分析结果表明个蛋白均含保守的结构域而端含、、、、和等结构域。启动子元件分析表明谷子个基因均含逆境应答元件其中和元件的数量最多个说明这些基因对干旱应答反应可能主要受、转录因子调控。转录组分析结果表明基因对干旱胁迫的响应远远高于其他成员对干旱、高盐、、和都有响应亚细胞定位结果显示蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解基因的功能提供了依据。F-box蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动, 对维持植物正常生长发育a和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性, 本研究根据谷子转录组分析结果, 从525个F-box家族成员中鉴定出19个在干旱胁迫下表达量上调的F-box基因; 根据序列相似性将其分为6类, 同一类基因具有相似的内含子-外显子结构; 染色体定位分析发现, 这些基因分别分布在谷子的8条染色体上, 其中, 第2条染色体上含F-box基因最多, 有6个。结构域分析结果表明, 19个F-box蛋白均含保守的F-box结构域, 而C端含FBD、WD40、FBA、ZnF、Kelch和LRR等结构域。启动子元件分析表明, 谷子19个F-box基因均含逆境应答元件, 其中, MYB和MYC元件的数量最多(9~78个), 说明这些基因对干旱应答反应可能主要受MYB、MYC转录因子调控。转录组分析结果表明, SiF-box18基因对干旱胁迫的响应远远高于其他F-box成员, 对干旱、高盐、ABA、SA和JA都有响应; 亚细胞定位结果显示, SiF-box18蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解SiF-box18基因的功能提供了依据。     

腐植酸对干旱胁迫下谷子幼苗叶片抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响

为探讨腐植酸（HA）对干旱胁迫下谷子抗氧化系统的调节机制,以晋谷21号和张杂10号为材料,采用浸种法研究了不同浓度腐植酸（0、50、100、200、300mg/L）对干旱胁迫下谷子幼苗叶片抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环的影响。结果显示,100和200mg/L腐植酸处理显著提高了干旱胁迫下谷子幼苗叶片抗坏血酸过氧化物酶（APX）和脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的活性,促进了抗氧化物质AsA和GSH的再生,使AsA/DHA和GSH/GSSH值增加,有效缓解了活性氧的积累。研究表明,腐植酸可通过提高AsA-GSH循环相关酶活性及抗氧化物质含量,缓解干旱胁迫对谷子幼苗造成的氧化损伤,从而提高谷子的抗旱性。     

谷子品种农艺性状的灰色关联度分析及综合评价

为合理利用引进的谷子材料,为杂交亲本选配提供试验依据。以引进的30份谷子种质资源为材料,采用灰色关联度和因子分析法对9个农艺性状进行关联和综合评价。结果表明,与单穗重关联的性状由大到小依次分别为穗粒重、穗粗、穗松紧度、穗长、穗毛长短、千粒重、株高、节数及叶片数。以性状灰色关联所占比重为权重,‘09-221’、‘赤谷8号’、‘朝谷13’、‘371’、‘黄金吨谷’等5份品种的加权关联度综合评价较高。因子分析中前5个公共因子分别为单株产量因子、穗性状因子、茎叶因子、穗松紧度因子和穗毛长短因子,它们的累积贡献率为93.36%。以公共因子的贡献率为权重计算综合评分,‘大同33’,‘大红谷’,‘Jul-108’,‘鑫谷10号’,‘09-220’等5份品种的得分高,综合性状好。     

两个谷子CIPK基因在非生物逆境胁迫下的表达分析

CIPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴定出2个CIPK基因, 命名为SiCIPK6和SiCIPK16。序列分析表明SiCIPK6基因组序列长1994 bp,编码451个氨基酸;SiCIPK16基因组序列长1885 bp,编码473个氨基酸,2个基因均无内含子和可变剪切。生物信息学分析显示这2个基因在蛋白质序列和结构上与其他物种CIPK基因一样非常保守。实时定量PCR分析表明SiCIPK6和SiCIPK16在ABA、低温、高温、干旱、高盐诱导下表达量均有所上调, SiCIPK6基因在ABA、干旱和盐处理时表达量上调幅度较大,而SiCIPK16基因在低温、干旱和高温处理时表达量上调幅度较大。半定量PCR检测结果表明SiCIPK6和SiCIPK16两个基因在拔节、孕穗、灌浆期时均有表达,在相应生育时期受到干旱胁迫时它们表达量均有所提高。推测SiCIPK6和SiCIPK16基因在谷子的干旱或其他逆境胁迫中起一定作用。     

谷子DnaJ蛋白基因的克隆

DnaJ蛋白是近年研究较多的同热激等胁迫反应相关的基因。本研究用0.8%NaCl胁迫下的谷子幼苗提取RNA,用反转录酶M-MLV扩增得到第一链cDNA,再以第一链cDNA为模板进行PCR扩增,克隆获得了完整的谷子DnaJ蛋白基因,该基因cDNA全长1 260 bp,编码419个氨基酸,具有DnaJ蛋白分子伴侣系统的3个保守结构域。将谷子DnaJ蛋白基因构建入表达载体pGFP,获得了谷子DnaJ基因的表达载体。该基因的克隆和表达载体构建,为谷子DnaJ蛋白基因的功能分析以及谷子耐热抗旱机理研究有重要意义。     

谷子几种农艺性状基因染色体定位及连锁关系的初步研究

利用三体分析法进行谷子染色体基因定位。以豫谷1号三体1-7、四体8和四体9为母本,显性矮秆、法谷56-81、马青苗为父本,配置组合分别进行显性矮秆基因、白米基因和青米基因染色体定位。根据三体1-7植株形态特征和父本标志性状鉴定各自的杂种F₁,采用细胞学方法,通过检查植株根尖染色体数来鉴定杂种F₁的三体8和三体９。经调查和分析各种三体杂种F₂性状分离情况,把显性矮秆基因定位在3号染色体,白米基因定位在4号染色体,青米基因定位在6号染色体。对不同区域的9个青米品种等位检测表明,这些青米基因都是等位基因。以两点测验法,配置组合1066A×法谷56-81和1066A×马青苗进行基因连锁分析。结果,4号染色体上糯性胚乳基因与白米基因间的交换值为（28.9±4.4）cM;6号染色体上1066A不育基因与青米基因间的交换值为（23.2±1.8）cM。