我国部分地区牛轮状病毒的病原学调查及一株G1OP[11]型牛轮状病毒的分离鉴定

应用轮状病毒RNA电泳方法，对内蒙古、黑龙江、新疆、北京、安徽等地共90份犊牛腹泻粪便样品进行检测。在内蒙古和新疆采集的粪样中共检出11份轮状病毒阳性样品，平均阳性率为12％（11／90）。阳性样品经RT-PCR分型鉴定，新疆2份和内蒙古5份样品属于G10型，新疆另一牛场的4份样品属于G6型。对所有阳性样品进行病毒分离，获得1株能在MA104细胞上稳定传代的病毒株，经鉴定该分离株属于G10P[11]型轮状病毒，命名为HM26。G10型牛轮状病毒的分离在国内尚属首次。     

黑龙江省大庆市部分地区牛轮状病毒腹泻的分子流行病学调查

为了对黑龙江省大庆市部分地区犊牛轮状病毒腹泻的流行情况进行调查,应用RT-PCR技术对随机采取的6份犊牛腹泻粪便样品的轮状病毒VP7基因进行扩增,采用多重半套式PCR方法对VP7基因阳性样本进行分型鉴定。结果显示,6份犊牛腹泻粪便样品中牛轮状病毒VP7基因均为阳性;VP7基因阳性样本经RT-PCR分型鉴定,均属于G10型。该研究结果表明大庆地区引起犊牛轮状病毒腹泻的轮状病毒主要为G型,因此需要针对G型轮状病毒加以防控。     

G8P[1]型牛轮状病毒的分离鉴定及序列分析

为了对大庆地区患有腹泻疾病的舍饲牛进行病原鉴定,通过RT-PCR方法对病料进行检测,将轮状病毒阳性样品接种MA104细胞进行病毒分离,扩增分离株VP7、VP4片段,将扩增产物纯化后连接在pMD18-T载体上,转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中进行亚克隆,将鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定,并利用DNA Star与GenBank上的参考序列进行同源性分析。结果表明,从样品中分离到1株BRV毒株,将其命名NX23。核苷酸序列分析表明,分离株NX23属于G8P[1]型轮状病毒,确认了G8P[1]型牛轮状病毒在我国的流行,为我国BRV分子进化及其RV分子流行病学的进一步研究奠定基础。     

牛A群轮状病毒G10型XJ-2022株分离鉴定及基因型分析

【目的】 试验旨在对新疆某规模牛场患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定及基因型分析。【方法】 采用抗原诊断试剂盒方法对在新疆某牛场随机采集的15份腹泻犊牛粪便样品进行检测,对抗原检测结果为阳性的样品进行反复冻融和过滤处理,然后将样品接种于Marc-145细胞进行病毒的分离和传代。对分离毒株进行间接免疫荧光试验（IFA）和负染电镜观察进一步确定病原。对分离株的VP6和VP7基因进行PCR扩增测序,并对其进行基因相似性比对和进化树分析。【结果】 抗原诊断试剂盒结果显示,3份粪便样品呈牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）抗原阳性。将阳性粪便样品分别接种于Marc-145细胞,仅有1份样品连续盲传至第9代出现明显的细胞病变效应（CPE）。IFA结果显示,接种该分离株的Marc-145细胞有亮绿色荧光,对照组未见荧光。电镜观察可见约65 nm的圆形病毒粒子,并命名为XJ-2022株。经PCR扩增获得VP6和VP7基因的目的条带,长度分别为1 356和342 bp。基因相似性比对和遗传进化分析表明,VP6基因与人源A群轮状病毒参考株DB2015-066（LC367318.1）相似性最高且遗传进化亲缘关系最近;VP7基因与牛源G10轮状病毒参考株XJX2（MN937506.1）相似性最高,遗传进化亲缘关系最近,确定该分离株为A群G10型轮状病毒。【结论】 试验成功分离到基因型为A群G10型BRV XJ-2022株,该毒株为新疆地区首次发现的多宿主来源的基因重配病毒。     

中国不同地区猪轮状病毒的分离鉴定及分子流行病学分析

为鉴定国内不同地区猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRo V)并分析其分子流行病学特征,本研究将从我国不同地区收集病料中检测到的16份PRoV阳性仔猪粪便样品和小肠内容物处理后接种MA-104细胞,传代后进行荧光定量PCR (qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,并经电镜观察。结果显示,其中7份样品F1～F3代病毒液qPCR Ct值均随着传代次数的升高而逐渐降低,IFA鉴定结果显示均能在细胞中观察到特异性荧光,电镜观察到直径约70 nm无囊膜的病毒粒子,表明本实验分离到7株PRoV。利用RT-PCR扩增7株分离株和其余9份PRoV的阳性样品的VP7基因并测序分析基因型,基于VP7基因进行同源性和遗传进化分析。结果显示,16份阳性样品包含3种G型,即G9(7/16)、G4 (6/16)和G3 (3/16),同时G9型FJ-2021分离株和G4型JS01-2021分离株与近两年流行株亲缘关系较近。统计16份样品中G型PRoV的地域分布,结果显示华东地区有G9、G4和G3型的流行,四川有G3和G9型流行,广东有G9型的流行,分别与华东地区、四川地区和广西地区报道的流行G...     

一株牦牛源G6P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定及部分基因的序列分析

本研究的目的是分离、鉴定牦牛源牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)。将经RT-PCR检测BRV阳性的牦牛腹泻粪便样本接种MA-104细胞,进行病毒分离和鉴定,并对其VP4、VP6和VP7完整基因进行测序,分析其分子特征。结果显示:病毒盲传3代后出现细胞病变,至第7代后出现细胞病变的时间稳定,经蚀斑纯化后测得病毒滴度为10^8.39TCID₅₀·mL^-1。分离株经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察证实为BRV,命名为HY-1株;扩增HY-1株VP4、VP6和VP7完整基因序列,分析表明HY-1株为G6P[11]I2型;系统发育树显示,HY-1株VP4、VP6和VP7节段分别与中国牛源DQ-75株和印度牛源M-1和RUBV319株遗传演化关系最近,可能为重配毒株。与国内的G6型和P[11]型BRV毒株相比,HY-1株的VP4和VP7蛋白重要氨基酸位点变化较大。成功分离得到一株牦牛源BRV,基因型为G6P[11]型,为我国首次报道。     

新分离牛轮状病毒及其血清型的研究

从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一株轮状病毒,(CHLY)并以其感染的MA-104为试验材料,较为系统的对轮状病毒的形态结构及其宿主的超微病变进行了观察,并将其主要保护性抗原VP7基因克隆入pUCm-T载体进行序列分析及测定,鉴定其血清型。轮状病毒粒子为圆形颗粒,直径在60~70 nm之间,病毒粒子由双层衣壳包裹,呈典型的轮状病毒车轮状结构。在轮状病毒感染的细胞质中,可观察到处于不同发育阶段的子代病毒粒子。对轮状病毒的中和抗原VP7的序列分析结果表明CHLY与G6血清型轮状病毒RF株同源性最高,核苷酸同源性为98.9%,结果表明分离的轮状病毒CHLY株为G6型轮状病毒。     

新分离牛轮状病毒及其血清型的研究

从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一株轮状病毒,（CHLY）并以其感染的MA-104为试验材料,较为系统的对轮状病毒的形态结构及其宿主的超微病变进行了观察,并将其主要保护性抗原VP7基因克隆入pUCm-T载体进行序列分析及测定,鉴定其血清型。轮状病毒粒子为圆形颗粒,直径在60-70nm之间,病毒粒子由双层衣壳包裹,呈典型的轮状病毒车轮状结构。在轮状病毒感染的细胞质中,可观察到处于不同发育阶段的子代病毒粒子。对轮状病毒的中和抗原VP7的序列分析结果表明CHLY与G6血清型轮状病毒RF株同源性最高,核苷酸同源性为98．9％,结果表明分离的轮状病毒CHLY株为G6型轮状病毒。     

猪A群轮状病毒BJ株的分离与鉴定

轮状病毒是引起幼龄动物和儿童病毒性腹泻的主要病原,轮状病毒的分离鉴定为该病的流行病学调查和分子生物学特性研究奠定了基础。本研究采集北京某猪场腹泻发病仔猪肠内容物,将其接种MA104细胞,分离得到一株能产生明显细胞病变的病毒。对分离毒株进行胶体金、实时荧光定量RT-PCR和免疫荧光等方法鉴定,并对分离毒株的VP4、VP6和VP7基因进行测序及序列分析。结果表明,分离毒株为猪A群轮状病毒。按照A群轮状病毒的最新分类方法,确定该分离株VP4、VP6和VP7基因的基因型分别为P[13]型、I5型和G11型。因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/BJ/2015/G11P[13]。     

一株G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定与全基因组序列分析

为了对患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定,并进一步丰富我国牛轮状病毒(BRV)的流行病学数据,本研究采用RT-PCR方法对8份腹泻犊牛的粪便样品进行BRV VP7基因检测,结果显示有1份样品为阳性。将该阳性病料样品接种Marc-145细胞。对产生细胞病变(CPE)的阳性样品连续传5代后,经间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察,结果表明从粪便样品中分离的病毒为BRV,命名为DZ株。对DZ株的11个基因节段进行RTPCR扩增、测序、拼接后对11个基因节段进行同源性及分型分析;构建分离病毒VP7、VP4基因进化树,分析其遗传进化关系及其氨基酸序列的变异情况。结果显示,DZ株基因组10个基因节段分别与来源于牛(VP2、VP7、NSP1、NSP3)、犬(VP3、NSP5)、羔羊(NSP2)、马(VP6)、猕猴(VP1)、人(NSP4)以及人-牛基因重配(VP4)的轮状病毒株。其中VP1基因与猕猴轮状病毒(RRV)的同源性最高,为81.3%,但低于VP1基因分型的临界值83%,因此DZ株的VP1为新出现的基因型,命名为R17;分离株NSP3基因与法国RF株NSP3基因的同源性高达98%,DZ株与RF株的NSP3属于同一基因型,命名为T18型。所以,本研究分离的BRV DZ株的基因型为G6-P5-I2-R17-C2-M2-A3-N2-T18-E2-H5。VP7和VP4基因遗传进化分析结果显示,DZ株VP7基因来源于韩国KJ69-1株,VP4基因来源于美国疫苗株RotaTeq-SC2-9。与同源性最高的病毒株相比,DZ株VP4、VP7蛋白氨基酸序列分别发生了9处和8处突变。这些突变可能会引起VP7和VP4蛋白的抗原性和组织嗜性变化,进而影响病毒的免疫原性、宿主嗜性以及致病性。综上所述,DZ株是多宿主来源的基因重配病毒株,且主要抗原蛋白VP7和VP4发生了较大变异。本研究为我国BRV遗传进化及其分子流行病学和疫苗的研究奠定了实验基础。     

The rotavirus genus

Human rotaviruses, discovered nearly 20 years ago, have been proven to be major cause of paediatric diarrhoeal disease morbidity and mortality. The clinical significance of these viruses stimulated basic studies on their biology, molecular and antigenic properties and epidemiology. General features, clinical relevance, epidemiologic pattern and laboratory diagnosis of human rotavirus infections are here reviewed.     

Plaque assay of bovine rotavirus

Incorporation of trypsin and diethylaminoethyl-dextran in the overlay was found to be necessary for infectivity assay of the UK strain of bovine rotavirus by plaque assays. Small plaques of about 1 mm in radius were formed in BGM cells. Large plaques of about 3–4 mm in radius were consistently produced in monolayers of secondary calf kidney cultures.Key words: bovine rotavirus, plaque assay, trypsin, diethyl-aminoethy1-dextran     

Detection of rotavirus infection by immunodiffusion

Three precipitin reactions associated with bovine rotavirus infection were demonstrable by immunodiffusion. One of the reactions has been utilized in a diagnostic test for the detection of rotavirus in faeces, or specific antibody to rotavirus group antigen in serum or faeces. The test, based on bovine materials, appeared to be group-specific and effective in demonstrating rotaviral antigen or antibody in other species of animals, including human beings. The procedure was as efficient as electron microscopy in detecting evidence of rotavirus in faeces of calves and a range of other species.     

猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究

从吉林省某猪场发生腹泻的猪群粪便中,用MA-104细胞培养,分离到一株猪轮状病毒,盲传至4代,感染细胞出现明显病变,经电镜观察,见有典型的轮状病毒颗粒.其RNA电泳型为4:2:3:2型,属A群轮状病毒,同时对其蚀斑特性和血凝特性进行了初步研究,这株病毒被命名为JL94株.     

Epizootiology of bovine rotavirus infection.

Published information on rotaviruses as pathogens, the source of virus infection and the method of transmission of infection under normal conditions are reviewed. The antigenic differences between rotavirus isolates from children, calves, pigs, foals and mice are discussed. Bovine rotaviruses isolated in the USA and the UK were shown to be closely related antigenically and the US vaccine strain protected calves from challenge with the UK rotavirus. Nineteen normally reared calves, with 20 or more ZnSO4 units of serum delta globulin, were susceptible to rotavirus inoculation at two days of age. They developed diarrhoea, showed body weight loss but recovered. Three calves with less than 10 ZnSO4 units of serum delta globulin developed diarrhoea and died. In a serological survey of 654 adult cows and calves from three herds, between 2 per cent and 37 per cent of individuals in a group had low rotavirus antibody titres and were probably susceptible to rotavirus infection. These were found in all age groups of animals studied, whether or not the group had suffered a recent rotavirus epizootic. It was not possible to predict whether an epizootic would develop on the basis of a serological survey.     

动物轮状病毒分离鉴定

应用MA-104细胞静置培养，胰酶处里样本的方法从仔猪和羔羊泻便中分离到两株轮状病毒(暂定名为PRV与SWV)。细胞培养证实所分离毒株均适应于MA-半连104细胞，并且产生明显的CPE；SPAIEM检查证实，PRV和SRV均呈现十分典型的轮状病毒的形态特征；理化及生物学特性检查结果显示：PRV和SRV对有机溶剂(乙醚、氯仿)、温度(50℃ 30min)、酸碱度(pH3．0)均有抵抗力；中和试验证实所分离毒株与NCDV有血清学相关性；RNA-PAGE有11条RNA带，其带型与有关资料报道相吻合，为4、2、3、2带型，但两株分离毒株的带型有一定的差异。