柑橘10个品种实生后代多倍体的发掘及SSR鉴定

秋季采摘柑橘成熟果实并剥取种子,将小粒种籽和瘪籽播于MT培养基,待萌发长出2～3片真叶时,取其叶片检测倍性;将饱满种籽播种于露地,对其幼苗首先通过形态筛选获得似多倍体的植株,然后取其叶片用流式细胞仪进行倍性检测;最后对获得的多倍体植株进行SSR分子鉴定。试验结果表明,获得早金甜橙、卡特夏橙、塔罗科血橙、日辉橘、Ortanique橘橙、默科特橘橙、华农本地早橘、朱红橘和Flame葡萄柚等9个品种的四倍体分别为6、1、3、12、3、6、2、1和10株;获得早金甜橙、塔罗科血橙、Itabori甜橙和Ortanique橘橙等4个品种的三倍体分别为1、1、2、4株。用13对多态性SSR引物对胚抢救获得的三倍体和四倍体的来源进行鉴定,发现早金甜橙、Itabori甜橙的三倍体再生植株为异源三倍体;塔罗科血橙、Ortanique橘橙的三倍体可能为同源三倍体;早金甜橙和Ortanique橘橙的四倍体可能为同源四倍体;塔罗科血橙四倍体为异源四倍体。采用37对多态性引物对从饱满种籽中获得的8个品种四倍体的来源进行鉴定,发现均为同源四倍体。这些自然发掘的多倍体资源对柑橘无核育种和相关基础研究具有重要价值。     

沙田柚（2x）× 柑橘异源体细胞杂种NS（4x）的三倍体后代遗传分析

 用两对SSR 引物TAA1 和TAA3 对以二倍体沙田柚为母本,体细胞杂种NS（Nova 橘柚 + Succari 甜橙）为父本,通过有性杂交和胚挽救获得的79 株三倍体后代群体的带型和分离情况进行了分析。结果发现TAA1 引物和TAA3 引物在后代群体中分别扩增出5 种带型和4 种带型,子代带型分别符合4︰1︰1︰5︰1 和2︰2︰1︰1 的分离比例,与根据孟德尔遗传规律推导的双二倍体的分离比例相吻合,初步表明柑橘异源四倍体体细胞杂种减数分裂行为类似于双二倍体。     

沙田柚多倍体遗传差异的SSR分析

应用21对柑橘SSR引物对7份有沙田柚血缘的不同倍性材料进行了基因组的遗传差异分析。平均每对引物扩增出3个等位基因,每对引物可检测到的等位基因数目为2～5个不等,多态性带纹为62.5%。NTSYS软件进行相似系数计算,7份材料的相似性系数为0.763～0.892。UPGMA法聚类分析,在相似性系数为0.83处可划分为3类,即3株天然四倍体为第Ⅰ类;2株人工同源四倍体与1株天然三倍体为第Ⅱ类;二倍体母株为第Ⅲ类。天然三倍体与二倍体的遗传相似性较四倍体与二倍体的遗传相似性更高。4对引物(CAT01,TAA33,AG14 and TC26)可以区分天然四倍体与人工同源四倍体。与亲本二倍体母本相比,所试三倍体和四倍体均发生了DNA水平变异,表现为带纹缺失同时又增加了新的带纹。这些多倍体试材可为培育无核三倍体柑橘提供丰富变异的亲本材料。     

白芨SCoT分子标记技术体系的建立及其在快繁苗遗传稳定分析中的应用

以4个不同继代的白芨快繁苗为试材,采用L_(16)(4~5)正交实验设计,建立了白芨SCoT-PCR的反应体系,并利用该体系分析不同继代的白芨快繁苗遗传稳定性。结果表明:白芨的SCoT-PCR最佳反应体系(20μL)中包含2.500 mmol·L~(-1) Mg~(2+),0.25mmol·L~(-1) dNTPs,1.50 U Taq DNA聚合酶,1.000μmol·L~(-1)引物,10ng模板DNA。遗传稳定性分析发现,SCoT引物均能在4个不同继代的白芨快繁苗中扩增出清晰、丰富而稳定的条带,但每个引物的条带均无多态性。说明白芨快繁苗并未发生变异,其遗传稳定性较好。     

以异源四倍体体细胞杂种为父本与二倍体杂交创造柑橘三倍体的研究

 2001～2002连续两年, 以沙田柚、本地早橘、中秋橘、HB柚、国庆4号温州蜜柑等二倍体品种为母本, 以NS (橘柚+无酸甜橙) 、NH (橘柚+ HB柚) 、SH (无酸甜橙+ HB柚) 、VM (伏令夏橙+橘橙) 、HD (甜橙+丹西橘) 等优良四倍体体细胞杂种的花粉授粉, 通过胚挽救技术获得再生植株。经细胞流式仪和染色体计数观察表明, 两年从10个授粉组合中共获得244株三倍体和10株四倍体。在这些三倍体中有147株来自沙田柚为母本的组合。目前已有172株三倍体和4株四倍体植株移栽成活。这些材料为进一步选育无核三倍体品种奠定了基础。     

菊属植物SCoT分子标记技术在遗传多样性分析中的应用

 采用正交设计方法,对Mg²⁺、dNTPs和引物浓度、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量等5个因素进行筛选,得到适于菊属植物的SCoT标记PCR反应体系,25 μL体系中含有：Mg²⁺ 1.2 mmol · L^-1、dNTPs 0.15 mmol · L^-1、引物0.8 μmol · L^-1、TaqDNA聚合酶1 U、模板DNA 50 ng。优化的最适退火温度为49.4 ℃。改进电泳方法,采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染法染色。运用不同倍性菊属材料基因组DNA对优化的SCoT-PCR反应体系进行验证,获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明确立的菊属植物SCoT分子标记技术体系稳定可靠。利用该体系及筛选出的12个SCoT引物,对18份菊花近缘种属材料的遗传多样性及亲缘关系进行分析,共检测到209个位点,其中多态性位点数189个,多态性比率为90.43%。应用NTSYS-pc2.1软件,计算菊花近缘种属材料之间的相似性系数并采用不加权成对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析,结果18份菊花近缘种属材料的遗传相似性系数范围为0.4516 ~ 0.7035,平均遗传相似性系数为0.58。聚类分析显示在相似系数0.530处可以将18份材料分成Ⅰ、Ⅱ两个大组,Ⅱ组包括芙蓉菊和绢毛蒿,其余16份材料属于Ⅰ组。Ⅰ组在相似系数0.615水平又分为6个亚组。结果表明SCoT分子标记体系适用于菊属及其近缘属种遗传多样性及亲缘关系的研究。     

草莓属植物SCoT分析体系的建立及优化

为利用SCoT技术开展草莓属(Fragaria)植物种质资源遗传多样性及分子系统学研究,以草莓属植物11个野生种和1个栽培品种为试材,采用L25(56)正交试验设计,建立了草莓属植物的最优SCoT-PCR反应体系,即20μL反应体系中,含Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 mmol·L-1、Taq酶0.75 U、引物0.75μmol·L-1、模板DNA 40 ng,并对退火温度进行了优化,对电泳检测方法及草莓属植物DNA提取方法进行了改进。共筛选出22个适于进行草莓属植物SCoT分析的引物。经验证,该反应体系稳定性好、可重复性强、多态性高、扩增效果好,适于草莓属植物的SCoT分析。     

玫瑰SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

以玫瑰为试材,采用L16(45)正交设计和单因素试验2种方法,研究模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq酶5个因素对玫瑰SCoT-PCR反应体系的影响,建立最优化的反应体系并筛选合适引物。结果表明:模板DNA浓度为1.50ng/μL,Mg2+浓度为2.00mmol/L,dNTPs浓度为0.35mmol/L,引物浓度为0.70μmol/L,Taq酶用量为0.50U时,可建立玫瑰SCoT-PCR最佳反应体系,并筛选出20条扩增条带清晰、多态性丰富的SCoT引物。反应体系的优化及引物的筛选,为日后利用SCoT分子标记技术对玫瑰进行相关研究提供理论依据和技术支持。     

龙眼24个品种的SCoT遗传多样性分析

利用SCoT标记对24份龙眼品种资源进行了检测。从80条引物中筛选出24条重复性好,条带清晰的引物进行PCR扩增,共扩增出211条带,其中181条具有多态性,多态性带比率为85.8%。24个龙眼品种间遗传相似系数在0.65 ~ 0.86之间,说明SCoT标记能够揭示材料间较高的遗传多样性。UPGMA聚类分析显示,SCoT标记能将24份龙眼品种完全区分开,并分成两类。     

红毛丹ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

采用单因素和正交试验对红毛丹ISSR-PCR反应体系中的各组分(DNA、引物、Mg~(2+)、dNTPs和Taq DNA聚合酶)进行了优化比较,确定了最佳的20μL反应体系包括DNA模板30ng、dNTPs 0.1mmol/L、引物0.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0U、Mg~(2+)2.0mmol/L;进一步利用该体系从20条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好的引物9条,从3个红毛丹品系中共扩增出多态性条带204条,多态条带比例达76%。     

结球甘蓝SSR检测体系的建立及优化

摘,要：以结球甘蓝自交系15R(南宝)和14S（北黑大平头）为试材,建立了甘蓝SSR-PCR反应体系,并从 PCR反应组成、扩增程序等环节对SSR-PCR反应体系进行了优化。即10.00 μL反应体系组成为：1× Buffer(含20.00 mmol·L^-1 MgCl₂)、50.00 μmol·L^-1 dNTPs、0.40 U Taq DNA聚合酶、0.40 μmol·L^-1 SSR引物、1.00 μL DNA(60.00 ng·μL^-1),加ddH2O至终体积10.00 μL;对基本扩增程序作了改进,适 宜的扩增程序为：94 ℃预变性5 min后进行20个迫降循环,94 ℃变性45 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸 1 min,每个循环降低0.5 ℃;再进行15个循环,94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min;72 ℃延伸10 min,16 ℃保存。对PCR产物的电泳检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染法）。     

大白菜、青花菜和叶用芥菜体细胞杂交种形态学与细胞学特性鉴定

 为拓宽十字花科蔬菜育种种质资源,以大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）、青花菜（B. oleracea L. var. varitalica）和叶用芥菜（B. juncea L. Czern）的子叶、下胚轴为材料,分离、纯化原生质体,采用40% 聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）融合法进行原生质体融合。融合细胞在附加0.2 mg · L^-1 2,4-D + 0.5 mg · L^-1 6-BA + 0.1 mg · L^-1 NAA + 0.1 mg · L^-1 激动素（kinetin）的改良K8p培养基中液体培养,当细胞分裂至8 ~ 10细胞期时,将分裂的细胞包埋于0.15%琼脂糖,然后在添加0.3 mol · L^-1蔗糖和2 mg · L^-1 6-BA + 2 mg · L^-1 玉米素（zeatin）+ 1 mg · L^-1 NAA + 0.5 mg · L^-1 kinetin的Kao培养基中诱导愈伤组织。将培养获得的936个愈伤组织转到3种不定芽诱导培养基MS + 5 mg ? L-1 zeatin + 2 mg · L^-1 IAA;MS + 2 mg · L^-1 zeatin + 2 mg · L^-1 IAA;MS + 0.5 mg · L^-1 6-BA + 0.5 mg · L^-1 NAA上诱导芽分化,当芽长3 cm左右时,转到1/2 MS + 0.2 mg · L^-1 NAA的生根培养基上诱导生根,共获得了96株再生植株,对其进行形态学、细胞学和分子生物学鉴定。形态学观察显示再生植株表型变化大,包括3个亲本的中间型或两个亲本的中间型;PCR技术鉴定结果显示96株杂种植株中93株为细胞质雄性不育特性;染色体计数显示,再生的植株染色体数变化范围广（2n = 38 ~ 64）,但未发现染色体数总和与3种融合亲本染色体数总数（2n = 74）相一致的个体。基因组原位杂交（Genomic in situ hybridization,GISH）和扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism,AFLP）分析结果表明,再生植株基因组中分别检测出大白菜、青花菜、叶用芥菜的DNA片段,证实了大白菜、青花菜、叶用芥菜种间体细胞杂交种的真实性。     

梨组织中苹果褪绿叶斑病毒的原位RT-PCR检测

 为了建立梨树苹果褪绿叶斑病毒原位RT-PCR检测技术, 用已知带有苹果褪绿叶斑病毒的库尔勒香梨和无病毒实生苗叶片为材料, 利用D IG标记, 研究了香梨病毒的叶片石蜡切片IS-RT-PCR检测技术。包括AMV逆转录酶、dNTPs、RNasin及互补引物浓度对cDNA合成的影响, 退火温度、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺ 、引物浓度及循环次数对原位PCR效果的影响。结果表明: RNasin的用量大于0.2 U·μL^-1时,信号强度随着RNasin量的加大而增强; 只有当dNTPs浓度达1.0 mmol·L^-1时才能生成一定量的cDNA;AMV浓度在0.3～0.5 U·μL^-1均可进行正常的逆转录, 而且在该范围内产物的量随AMV浓度提高而增多; 引物浓度达到0.9μmol·L^-1以上时才能进行有效的逆转录, 并且生成的cDNA的量随引物浓度增大而增加。原位扩增ACLSV的cDNA适合退火温度为56℃。循环20～30次可出现较强的蓝色信号, 引物浓度在0.8～1.2μmol·L^-1时显色较好; Taq酶浓度为20 U·mL^-1以上, 均显示较深的蓝色; Mg^{2 +}浓度为1.5mmol·L^-1就可满足原位PCR所需。获得了苹果褪绿叶斑病毒的原位PCR优化检测体系, 利用建立的优化程序对香梨样品进行了检测验证, 取得了很好效果。     

苹果柱型基因的ISSR分子标记研究

 以普通型苹果品种‘富士’和柱型苹果‘舞姿’以及其杂交后代的柱型与非柱型实生苗为试材, 建立了苹果的ISSR ( Inter-Simple Squence Repeat polymorphic DNA) 分子标记体系, 并将ISSR 标记用于苹果柱型基因Co 的遗传分析。结果表明, 在20μL 反应体系中各组分的用量为Taq DNA 聚合酶1U、Mg²⁺ 的浓度为2.5 mmol·L^-1 、模板DNA 用量20 ng、引物浓度0.2μmol·L - 1及退火温度52 ℃, 80 %引物具有良好的扩增能力。调整模板DNA 的用量、引物浓度及退火温度能够优化苹果ISSR-PCR 扩增体系。从所筛选的65 个引物中获得了35 个ISSR 标记, 其中33 个标记呈现1∶1 分离, 可用于苹果柱型基因的遗传分析。     

柑橘4种砧木幼苗对铜过量胁迫的生理响应与耐受性差异

为探究不同柑橘砧木的铜过量胁迫耐性差异,分析砧木铜过量胁迫的生理响应,试验选用4种常用的柑橘砧木枳、资阳香橙、红橘和沙田柚180d实生苗为材料,用1.5(对照)、7.5、37.5、187.5和937.5μmol·L^-1的CuSO₄溶液进行处理。结果显示,高浓度CuSO₄处理导致叶绿素含量和光合能力下降,叶片细胞相对电导率和MDA含量值显著上升;SOD、POD酶活性上升;高浓度下,砧木对K、P、Ca、Mg、Fe、Mn和Zn营养元素的吸收和转运下降。高CuSO₄处理导致砧木叶片黄化脱落,根系褐变短小,生长受阻,严重时死亡。不同砧木对CuSO₄过量胁迫耐受性差异明显,枳最先出现新叶失绿、老叶落叶、生长量下降和光合等生理指标下降,随后依次为沙田柚、红橘和资阳香橙。主成分分析和隶属函数综合分析显示,资阳香橙对铜过量胁迫耐性最强,红橘其次,沙田柚再次,枳对铜过量胁迫最敏感。     

镁胁迫对‘春见’橘橙生长和矿质元素分布及叶片超微结构的影响

 采用砂培法,研究了不同浓度镁[0、2.4、12、24（对照）和240 mg · L^-1]对香橙砧‘春见’橘橙幼苗的生理胁迫反应。结果表明：（1）镁缺乏和镁过量胁迫均显著降低了株高、根长、根系活力、叶绿素含量及各部位干样质量,但显著提高了相对电导率与MDA含量,且均以无镁处理的对应值变幅最大,无镁处理还显著降低了SOD与CAT活性。（2）植株各器官镁含量随镁处理浓度的升高而增加,同一处理下叶片镁含量相对高于其他部位,上部叶镁含量高于下部叶（镁过量处理除外）;镁胁迫处理不同程度地降低了各部位的锌含量,尤以2.4 mg · L^-1 Mg ²⁺处理明显;除无镁处理外,各处理（含对照）的下部叶钙、硼含量均大于上部叶,镁过量处理显著降低了上部叶和下部叶的钙和硼含量。（3）叶肉细胞超微结构变化显著,镁缺乏处理导致叶绿体内类囊体片层模糊,片层数明显减少,线粒体膜模糊且出现异常的黑色颗粒;镁过量处理导致叶绿体内片层消失,淀粉粒和质体小球异常增多增大,线粒体膜模糊。     

东北百里香组培再生体系的建立

 以中国特有地被植物东北百里香为试材,研究了植物生长调节剂组合对腋芽萌发和茎段、叶片外植体愈伤诱导和不定芽分化的影响。结果表明：百里香茎段腋芽可直接诱导萌发,在MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + NAA 0.1 mg · L-1培养基上萌发率最高,达74%,在MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + NAA 0.1 mg · L-1的培养基上增殖倍数为36.43。由茎段萌发的组培苗在1/2MS + IBA 0.5 mg · L-1的培养基中20 d后生根率100%,移栽成活率76.7%。继代培养中叶片外植体可以诱导出愈伤组织,但是不能进一步分化成苗。茎段愈伤诱导的最适培养基为MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + 2,4-D 1.0 mg · L-1,再分化培养基为MS + 6-BA（0.1 ~ 1.0）mg · L-1 + GA3（0.1 ~ 0.5）mg · L-1,分化率为33.3%。     

硒对酥梨叶片衰老及抗氧化酶系统的影响

 研究喷施Na₂SeO₃对砀山酥梨（Pyrus bretschneider Rehd.‘Dangshan Suli’）叶片衰老及抗氧化酶系统的影响。结果表明：与对照相比,喷施低浓度的硒（5 mg · L^-1）,可明显延迟衰老叶片含水量、干样质量、叶绿素和可溶性蛋白含量的下降,显著提高SOD和GSH-Px活性,降低H₂O₂、和MDA含量,平均延迟落叶7.25 d;喷施中等（10 mg · L^-1）和高浓度（20 mg · L^-1）的硒对延缓叶片衰老的效果变差,且浓度越高,效果越差;叶面喷硒对POD活性具有抑制作用。硒延缓梨树叶片衰老存在浓度差异,低浓度的硒可能通过提高SOD、GSH-Px等酶的活性参与叶片衰老进程的调控,从而降低膜脂过氧化水平,延长叶片功能期。     

柑橘落花落果的营养元素含量及其脱落损耗

 以成年纽荷尔脐橙、兴津温州蜜柑和沙田柚为材料,研究落蕾、落花和脱落幼果中的养分 含量及其脱落造成的损耗。结果表明,3 个品种的蕾和花营养元素含量为N 3.34% ~ 3.66%,P 0.26% ~ 0.31%,K 1.67% ~ 2.30%,Ca、Mg 和S 含量0.17% ~ 0.48%,Fe、Mn、Zn、Cu 和B 含量8.1 ~ 87.5 mg · kg^-1。 除花的B 含量显著高于蕾外,花和蕾的多数营养元素含量相近,且品种间差异小。与蕾和花相比,幼果 的N 和P 含量较少,N 和P 含量分别少21.8%和19.5%,但Fe 含量较多,其它营养元素含量变化不明显。 纽荷尔脐橙、兴津温州蜜柑和沙田柚单株脱落的蕾、花和幼果干物质量合计分别为3 016.3 g、3 533.6 g 和1 486.7 g,由此所造成的单株主要养分损耗为N 49.2 ~ 119.4 g、P 4.3 ~ 10.1 g、K 30.1 ~ 76.2 g、Mg 2.5 ~ 7.1 g、Zn 24.0 ~ 81.5 mg 和B 65.5 ~ 170.2 mg。兴津温州蜜柑和沙田柚均以落花的养分损耗最大,落蕾其 次,落果最小;纽荷尔脐橙则是落花和落蕾的养分损耗相近且远高于落果。品种间以兴津温州蜜柑脱落 的养分损耗最大,纽荷尔脐橙其次,沙田柚最小。因此,柑橘应控制过量开花,并在萌芽开花期及时补 充养分。