培养条件对海豚链球菌的生长及其胞外产物蛋白组成的影响

本文研究了培养条件对海豚链球菌(Streptococcus iniae)NUF849生长的影响,分析了不同培养条件下海豚链球菌胞外产物的蛋白组成变化。结果显示,海豚链球菌在28℃时生长状态最好,胞外产物最丰富,主要有92 kDa、88 kDa、68 kDa、62 kDa、57 kDa、50 kDa、46 kDa、42 kDa、38 kDa、37 kDa、36 kDa、30 kDa、27 kDa和24 kDa等蛋白条带,温度升高或降低皆使蛋白条带减少;相对于普通气体环境,5%~10%CO_2对海豚链球菌的生长无显著影响,但使胞外产物蛋白条带减少,92 kDa、88 kDa、62 kDa、37 kDa和27 kDa条带丰度升高;培养基含2‰葡萄糖和5‰NaCl时,海豚链球菌生物量最高,5‰和10‰葡萄糖均可增加胞外产物蛋白条带,提高68 kDa、57 kDa、37 kDa和27 kDa蛋白丰度,但20‰葡萄糖和高于10‰的NaCl会抑制海豚链球菌的生长并减少胞外产物蛋白丰度;培养基中添加二联吡啶(DPD)和FeCl_3时,海豚链球菌生长受到抑制,胞外产物蛋白条带较BHI培养基条件下明显减少。本文结果有助于认识海豚链球菌对外界环境条件的反应,为揭示其致病机理提供依据。     

Smad2基因在敖汉细毛羊不同发情时期卵巢中的表达分析

Smad2基因是Smads蛋白家族的成员之一,Smad家族中的信号分子对绵羊的繁殖、卵泡发育有重要影响。本实验选取24只3~4岁健康空怀敖汉细毛羊,采用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组织化学技术,测定Smad2基因在绵羊不同发情时期(乏情期、发情间期、发情前期、发情期)的表达量并分析其在卵泡中表达规律。结果表明:Smad2基因m RNA和蛋白均在绵羊发情前期表达量最高,m RNA水平极显著高于乏情期、发情间期和发情期(P0.01);而发情前期蛋白水平极显著高于乏情期和发情期(P0.01),虽高于发情间期,但差异不显著(P0.05);Smad2蛋白主要在卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞以及卵母细胞表达。据此,Smad2基因可能会促进敖汉细毛羊的发情启动。     

奶山羊发情期与间情期卵巢中CircRNA差异性表达谱分析

circRNAs参与许多重要的生物过程,并作为miRNA的"分子海绵"发挥重要作用。目前关于卵巢中circRNA的种类、数量、功能及其对卵巢发育的调控机理研究报道很少。本研究以发情期与间情期的奶山羊卵巢为研究对象,通过样品提取总RNA后并对其进行处理之后制备整个文库的策略,利用IlluminaHiSeq进行高通量测序并进行分析、生物信息学方法,采用RT-qPCR等检测技术,研究了奶山羊发情期与间情期卵巢组织中差异的circRNA表达谱。结果表明,奶山羊发情期和发情间期卵巢组织中候选的circRNA有22,333个,可分为六类;奶山羊发情期卵巢相对发情间期有772个circRNA差异性表达,268个上调,504个下调;奶山羊卵巢组织中除了Y染色体,circRNAs在其他所有染色体上均广泛分布,大多数circRNA长度约为500nt。因此本研究对奶山羊发情期和发情间期卵巢组织中circRNA表达谱进行检测和分析,为进一步探索circRNA在奶山羊发情周期卵巢发育中的调控机理提供试验依据,也为提高奶山羊的繁殖率提供新的思路与方法。     

Smad1基因在敖汉细毛羊发情不同时期卵巢中的表达规律研究

为了探索Smad1 mRNA及其蛋白在敖汉细毛羊不同发情时期卵巢中表达量的变化规律,试验采用实时荧光定量PCR、免疫组化方法分析绵羊不同繁殖状态下(乏情期、发情间期、发情前期、发情期)Smad1基因在卵巢中mRNA表达量的变化规律及卵巢中该基因蛋白的表达,并进行图像分析。结果表明:发情期Smad1基因表达量最高,极显著高于其他三个时期(P0.01);发情前期Smad1基因表达量显著高于乏情期和发情间期(P0.05)。在绵羊不同发情时期Smad1蛋白主要表达于乏情期原始卵泡、次级卵泡的颗粒细胞、发情间期次级卵泡的卵泡膜细胞,在发情前期与发情期卵泡中未见表达。卵巢中Smad1基因可能促进黄体溶解,对卵泡发育、卵子的成熟以及释放起作用,与绵羊发情的启动有一定关系。     

大鲵皮肤水溶性蛋白质成分分析及活性鉴定

该试验旨在研究大鲵(Andrias davidianus)皮肤水溶性蛋白成分及其活性,揭示大鲵皮肤黏液的蛋白组分,鉴定具有潜在功能活性的蛋白质。通过物理和化学刺激的方法收集大鲵皮肤黏液,制备大鲵皮肤黏液水溶性蛋白样品,并通过SDS-PAGE垂直电泳、细菌凝集试验、氧化物清除效率试验以及蛋白质谱Label-free分析大鲵皮肤黏液水溶性蛋白的成分以及活性。结果表明:大鲵皮肤黏液中含有多种水溶性蛋白,分子量介于10～300 kDa之间,其中50 kDa分子量以上蛋白条带较为丰富,在100 kDa分子量以上含有较多蛋白,14 kDa以下蛋白含量较少。大鲵皮肤黏液水溶性蛋白对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABST)2种自由基具有清除能力,说明其具有一定的抗氧化活性。大鲵皮肤黏液水溶性蛋白对大肠杆菌和嗜水气单胞菌2种细菌具有较强的凝集作用,暗示大鲵皮肤水溶性蛋白具有一定的抗菌活性。蛋白质谱Label-free分析表明这些蛋白是由66种蛋白质组成;通过分子注释有20种蛋白与免疫抗病功能相关,2种蛋白与抗氧化活性相关。研究揭示大鲵皮肤黏液水溶性蛋白含有66种蛋白,分子量介于10～300 kDa,活性鉴定结果显示大鲵黏液水溶性蛋白具有抗氧化活性和抗菌活性。     

阴道涂片法确定绵羊情期的研究

实验用阴道涂片法确定绵羊发情时期。在发情季节,把经试情确定发情周期正常的母羊于发情前期、发情期、发情后期和发情间期分别进行阴道涂片,观察各种细胞成分及其变化。结果说明,绵羊阴道涂片中主要可见到白细胞、有核上皮细胞、角化上皮细胞和细胞碎片等4种细胞成分。白细胞在发情间期数目最多,显著(P<0.01)多于其它各期;各时期有核上皮细胞的数目无显著差异;角化上皮细胞在发情期数目最多,明显(P<0.01)高于其它各期;发情间期和前期的细胞碎片明显(P<0.01)多于发情期和发情后期。因此,有可能以角化上皮细胞和白细胞的数目作为指标,确定绵羊的发情时期。     

NKB及其受体NK3R基因在发情周期不同阶段小鼠下丘脑-垂体-卵巢中的表达研究

为了揭示NKB/NK3R调控雌性哺乳动物生殖激素分泌的作用机制,试验将40只6～8周龄雌性小鼠按照发情周期不同阶段分类,处死后采集丘脑、垂体和卵巢组织,提取RNA,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测发情周期各阶段小鼠下丘脑、垂体和卵巢中NKB、NK3R基因的相对表达量并进行比较分析。结果表明：在发情前期和发情期,小鼠NKB基因的相对表达量均为垂体最高,卵巢居中,下丘脑最低;在发情后期,小鼠NKB基因的相对表达量为下丘脑最高,垂体居中和卵巢最低;在发情间期,小鼠NKB基因的相对表达量为下丘脑最高,卵巢居中,垂体最低。NK3R基因的相对表达量在发情前期、发情期、发情后期和发情间期的趋势一致,均为下丘脑最高,垂体居中,卵巢最低。各组织中,NK3基因的相对表达量均为发情前期最高,发情期居中,发情后期和发情间期较低。在下丘脑中,发情周期不同阶段NK3R基因的相对表达量差异不大;在垂体和卵巢中,NK3R基因的相对表达量均为发情后期最高,发情间期居中,发情前期和发情期较低。提示NKB/NK3R可能参与了雌性哺乳动物发情周期各阶段生殖激素的合成与分泌。     

绵羊脾脏淋巴细胞体外诱导培养及总RNA提取

本试验进行了绵羊脾脏淋巴细胞的分离、体外诱导培养和总RNA提取,经琼脂糖凝胶电泳证实为完整、均一的总RNA;将此法提取的RNA反转录成cDNA后经过PCR扩增,可获得清晰的目的条带。该方法简便、快速,提取的总RNA可以用于进一步基因克隆、表达。     

苜蓿总RNA提取方法比较研究

以苜蓿叶片为材料,利用紫外分光光度计和凝胶电泳法比较了改良CTAB法、异硫氰酸胍法、SDS法、Tris-热硼法和尿素法等五种方法提取的苜蓿总RNA的质量和纯度.结果表明:改良CTAB法提取的RNA的OD260nm/OD230nm大于2.O并且OD260am/OD280nm接近1.8,具有较高的纯度.凝胶电泳结果表明,改良CTAB法有28SrRNA和18S rRNA两条清晰的条带,且无降解;其它四种方法获得的RNA品质较差,有降解和弥散现象.将改良CTAB法提取的RNA逆转录成cDNA,经RAPD扩增后出现4条清晰的条带,进一步证明了改良CTAB法提取的总RNA具有很高的纯度,可以满足进一步分子生物学研究的要求.     

牦牛发情周期中卵巢卵泡发育状况的组织学观察

运用组织学技术对36头处于发情周期的健康成年母牦牛卵巢卵泡的结构与发育状况进行了观察。结果表明，牦牛发情周期中卵巢卵泡发育的组织结构与其他牛基本相似。每对卵巢中原始卵泡数和生长卵泡数在发情前期、发情期、发情后期和发情间期之间差异不显著（P〉0．05）；发情前期的囊状卵泡数与发情期、发情后期和发情间期之间差异不显著（P〉0．05），发情期和发情后期均与发情间期差异显著（P〈0．05）。闭锁生长卵泡数在4个时期之间差异不显著（P〉0．05）；发情期的闭锁囊状卵泡数与其他3期之间差异极显著（P〈0．01），发情前期和发情间期均与发情后期差异显著（P〈0．05）。各级卵泡的闭锁形式各有特点。在生长卵泡、囊状卵泡及相应闭锁卵泡的卵泡膜中均见到了胶原纤维和网状纤维。     

银染mRNA差异显示方法在致突变实验中的初步应用

为建立在药物致突变研究中应用银染 m RNA差异显示的方法 ,试验提取未经过 /经过环磷酰胺处理的 Balb/c小鼠肝组织的总 RNA ,并以此为模板 ,采用 d T1 2 CG、d T1 2 AG、d T1 2 GG为锚定引物 ,通过反转录、差异显示 PCR反应 ,以 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异条带 ,回收后将其再扩增。结果表明 ,RNA投入量为 3μg、镁离子浓度为 1.5～ 2 .0 mm ol/L、退火温度为 4 0℃时 ,扩增的片段条带清晰、背景低 ,差异条带明显 ,再扩增条带单一。银染 m RNA差异显示技术可成功应用于药物致突变的研究。     

高寒区牛内脏组织的采集及其RNA的贮存

牦牛所处环境及生物习性明显不同于普通牛,尤其组织样品获取不易,如何将来之不易的样品长时间高效保存意义重大。为此,本研究以天祝白牦牛及本地黄牛为对象,采集胃肠道、肝脏及肾脏样品,Trizol Kit提取RNA,运用食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)规则及Gel-pro软件分析-80℃保存1个月和23个月的RNA浓度及降解程度,研究RNA的保存与质量检测技术。结果表明,牦牛所有胃组织样品RNA放置23个月后浓度均增加,而黄牛的瘤胃及瓣胃却相反;两个基因型牛种空肠及牦牛回肠组织RNA相对稳定;牦牛和黄牛大肠RNA在保存23个月后浓度存在显著差异(P0.05)。牦牛及黄牛胃部及肝脏和肾脏RNA在保存23个月后,5S条带较清晰,28S和18S条带均不清晰;胃部、肝脏及肾脏28S∶18S在0.34~0.72,肠道28S∶18S在0.43~2.15。高寒牧区牦牛胃肠道等组织按Trizol提取方法可提取高质量的RNA样品,但常规方法保存23个月的RNA样品均会产生不同程度的降解,降解程度亦存在动物基因型及组织部位的差异性。     

梅花鹿毛发基因组DNA提取效果的分析

为了研究以梅花鹿毛发作为试验样本进行遗传多样性分析的可行性,试验以梅花鹿为试验材料,分别取5,10,20根毛发,采集血液和提取组织DNA,以微卫星位点2AL2为引物进行PCR扩增,对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果表明:毛发DNA与血液和组织DNA的数量和质量并无明显差异,10根毛囊DNA的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳均可观察到清晰条带,毛发DNA可作为梅花鹿遗传多样性分析的试验材料。     

转化生长因子βⅠ型受体基因在敖汉细毛羊不同组织及发情时期卵巢中的表达分析

试验旨在探究转化生长因子βⅠ型受体(transforming growth factor-beta receptorⅠ,TGF-βRⅠ)基因在敖汉细毛羊中的组织表达情况,以及在不同发情时期卵巢中表达量的变化规律,为探讨其与绵羊发情的关系奠定基础。以24只季节性发情的敖汉细毛羊为研究对象,分为乏情期、发情间期、发情前期和发情期4组,每组6只。首先利用实时荧光定量PCR检测其发情期甲状腺、下丘脑、垂体、卵巢、肾上腺、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、肌肉12个组织中TGF-βRⅠ基因的表达情况,其次对4个不同发情时期卵巢TGF-βRⅠ基因的表达量变化进行研究。结果显示,TGF-βRⅠ在各组织中均有表达,在卵巢和甲状腺中表达量最高,极显著高于其他组织(P0.01);在下丘脑、垂体、胰腺、肾上腺、脾脏和肺脏组织表达量较高,显著高于心脏、肝脏、肾脏和肌肉组织(P0.05)。卵巢中TGF-βRⅠ基因在发情前期表达量最高,极显著高于其他3个时期(P0.01),发情间期表达量最低,极显著低于其他3个时期(P0.01)。综上所述,卵巢组织中TGF-βRⅠ基因在发情前期时可能对排卵前卵泡的成熟起促进作用。     

家蚕卵、幼虫期蛋白SDS-PAGE电泳观察

1)蚕卵催青期的蛋白电泳图谱,1至7天基本无很大变化,到第8、9日,蛋白变化才明显。2)一至三龄整条蚕跑出来的蛋白带数少且不清晰。大蚕剔除中肠内桑叶后,蛋白条带多且较清晰。四至五龄蚕血蛋白质条带有一定的变化。3)同一天不同组织取样处理,蛋白质带数及成分有差异。     

不同保存时间和温度对狼山鸡全血基因组DNA的影响

保存好各个世代家禽血样和基因组DNA对于研究家禽各世代变化规律以及更好地监测家禽保种效果具有重要意义。试验分别抽取-20℃保存0.5年、1年、3年、5年、7年、8年和10年的狼山鸡全血基因组DNA样品,以及-70℃保存8年的狼山鸡DNA样品,采用核酸电泳和PCR检测,比较不同年份和不同温度保存DNA的效果。结果表明:DNA样品随着-20℃保存时间的延长,DNA越容易降解。-20℃保存10年的狼山鸡DNA降解率很高,条带模糊;-20℃保存8年和7年的DNA,降解也较严重;-20℃保存5年的狼山鸡DNA总体完好,条带相对清晰;-20℃保存3年、1年和0.5年的狼山鸡DNA条带清晰鲜明。-70℃保存8年的DNA条带清晰,无降解现象。降解的DNA浓度普遍显著低于不降解的DNA。DNA纯度均在1.8~1.9之间。降解和不降解的DNA用鸡内参引物PCR检测,均出现条带,说明DNA的部分降解不影响一般的PCR检测试验。本研究结果表明:-20℃保存5年以内DNA保存效果尚可,如果长期(5年以上)保存DNA,需-70℃超低温保存。     

光周期对奶山羊性激素分泌的影响

本研究以泌乳期崂山奶山羊为实验用动物,通过比较奶山羊在逐渐增加光照长度(渐增长光照)和在恒定短光照条件下发情表现及唾液中性激素水平的周期性变化,分析光周期对泌乳崂山奶山羊发情规律的影响。研究结果表明,渐增长光照组的发情周期极显著长于恒定短光照组(P0.01),且主要表现在发情间期极显著长于恒定短光照组(P0.01),两组发情持续时间相同,均为4d;两组奶山羊发情期唾液中雌激素(Estradiol,E_2)水平均极显著高于发情间期(P0.01),但恒定短光照组的奶山羊发情期唾液中E_2含量极显著高于渐增长光照组(P0.01),两组奶山羊发情间期唾液中E_2水平无显著差异。本研究结果提示,通过人工光照控制,可以调节奶山羊性腺轴的活动,提升奶山羊的繁殖频率。     

绒山羊泌乳期诱导发情效果及相关生殖激素变化

旨在研究燕山绒山羊母羊泌乳期诱导发情的效果及对相关生殖激素变化的影响。选择经产、体质量约为45 kg的泌乳期母羊45只,随机分为A、B和C组,分别于产后25,35,45 d采用孕酮阴道硅胶栓(CIDR)+促卵泡素(FSH)的方法诱导发情,统计96 h内发情率,在埋栓的0,4,9,13 d及试验羊发情时采血检测FSH、促黄体素(LH)、催乳素(PRL)、雌激素(E_2)和孕酮(P_4)浓度。结果显示,A、B和C组的发情率分别为60%,53.33%和80%,发情多集中在24～72 h;埋栓前,即试验0 d时A、B和C组FSH、LH、PRL、E_2和P_4无差异。FSH和LH在撤栓时达到最低,撤栓后升高;14～15 d,所有发情羊FSH和LH均高于未发情羊,但只有A、B组FSH差异显著(P0.05)。14～15 d,PRL浓度最低(P0.05);试验期间,除9 d外,C组发情羊PRL显著低于未发情羊(P0.05),其余各组内发情羊与未发情羊PRL无差异。14～15 d,3组发情羊血清中E_2迅速升高而P_4降低,E_2浓度高于埋栓期(P0.05),试验期间,各组内发情羊与未发情羊E_2和P_4无差异;0～15 d,各组发情羊之间及未发情羊之间PRL、P_4无差异,各组发情羊间FSH及未发情羊间E_2均无差异;4 d,A组未发情羊FSH低于B组(P0.05),LH高于C组(P0.05);13 d,B组发情羊LH低于C组(P0.05),14～15 d,E_2高于C组(P0.05)。结果表明,母羊产后45 d诱导发情效果较好;外源P_4可大幅度降低PRL,发情时FSH、LH和E_2的分泌同步上升。     

BAD基因在敖汉细毛羊发情不同时期卵巢表达规律及对生殖激素的影响

本实验研究旨在探究BAD基因在敖汉细毛羊中的不同发情时期卵巢中表达量的变化规律以及对生殖激素的影响,为探讨其与绵羊发情的关系奠定基础。首先利用放射免疫方法测定敖汉细毛羊血液中促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E_2)和孕激素(P_4)的浓度,然后利用qRT-PCR检测乏情期、发情前期、发情间期和发情期卵巢BAD基因的表达量变化。结果表明:卵巢中BAD基因在发情前期的表达量极显著高于乏情期、发情期和发情间期(P0.01),在发情期的表达量极显著高于乏情期和发情间期(P0.01),乏情期和发情间期的表达量基本相同(P0.05);E_2和LH浓度在BAD基因表达量最高的发情前期维持较高水平,P_4的浓度维持较低水平。综上可知,BAD基因的表达可能促进了E_2和LH浓度升高,抑制了P_4产生,进而影响细毛羊发情,可为绵羊发情的研究提供借鉴。     

三种奶牛冻精蛋白制备方法的效果比较

为了获得准确的奶牛冻精差异蛋白二维电泳(2-DE)分析结果,试验采用3种不同的方法,即改良TRIzol裂解法、改良三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法和尿素盐酸胍裂解法,对奶牛冻精蛋白进行裂解,通过蛋白核酸浓度测定仪测定不同裂解法提取的蛋白量,用SDS-PAGE凝胶电泳检测不同方法提取的蛋白量。结果表明:随着精子数量的增加,裂解获得的蛋白量随之增加,改良TRIzol裂解法得到的蛋白量最高,尿素盐酸胍裂解法最低,改良TRIzol裂解法精子数为2.0×107、3.0×107和4.0×107个时蛋白量分别为(1.73±0.07),(1.94±0.05),(2.50±0.38)μg/μL,显著高于其他两种方法(P0.05);三种不同裂解方法上样量均为25μL,即含蛋白质26.21~62.5μg,不同上样蛋白量比较,精子数3.0×10~7个获得的条带最清晰、无粘连;蛋白条带分布的比较,改良TCA-丙酮沉淀法获得的条带多集中在50~85 ku区域,而改良TRIzol裂解法在30~50 ku区域和14~25 ku区域(精子数为3.0×10~7和4.0×10~7个)。说明精子数为3.0×10~7个时采用改良TRIzol裂解法能得到更丰富、更全面的精子蛋白质种类,有利于二维电泳(2-DE)分析寻找差异蛋白质,为后续试验奠定基础。