猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒3/4/5型双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪博卡病毒(PBoV)3/4/5型的双重PCR方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ORF1基因序列和PBoV不同基因型VP1序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测PEDV和PBoV3/4/5型双重PCR方法,特异性检测结果显示该方法对猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、猪链球菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对PEDV和PBoV3/4/5型重组质粒标准品的最低检出量分别为837拷贝/μL和1 000拷贝/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出PEDV和PBoV3/4/5型混合感染及单独感染。本研究建立的双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测PEDV和PBoV提供了技术帮助。     

猪博卡病毒G1基因群和猪流行性腹泻病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立同时快速定量检测猪博卡病毒(PBoV)G1基因群和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究参照GenBank登录的PBoV的NP1基因和PEDV的M基因保守序列,设计了引物和探针,经优化反应条件后,建立了能够同时检测PBoVG1基因群和PEDV的双重TaqMan荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示该方法与PCV2、PRV、PDCoV、PRoV和TGEV无交叉反应,敏感性试验结果显示该方法对PBoV、PEDV的质粒标准品检测下限分别为21.8拷贝/μL和31.7拷贝/μL;且组内、组间变异系数均小于4%,重复性好。应用本实验建立的方法对2017年5月~2018年8月,河北省部分地区采集的142份仔猪腹泻样品检测结果显示,PBoVG1阳性率为18.3%(26/142),PEDV阳性率为62.7%(89/142),其中PBoVG1与PEDV共感染率为10.6%(15/142),该方法优于常规PCR方法。本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法对PBoV和PEDV的准确检测、病原监测、流行病学调查等均具有重要意义。     

猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒3型二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的二重PCR方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV M基因和PCV3 Rep基因高度同源保守序列设计并合成2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PCV3 Rep基因,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PCV3的二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:该方法对PEDV和PCV3的检测结果为阳性,而对猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒等8种常见的病原体均未检测到荧光信号;且具有良好的线性关系,R^2为0.99;应用本方法对PEDV和PCV3的最低检出量分别为37.6拷贝/μL和61.2拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。结果表明:本试验建立的PEDV和PCV3二重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效、定量检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R²值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%～0.43%,组间变异系数为0.67%～0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。     

鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株与疫苗株双重RT-PCR检测方法的建立

为建立鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株与疫苗株的检测方法,本研究根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M、ORF3基因序列,设计合成了2对特异性引物,通过PCR扩增条件的优化,建立了鉴别PEDV野毒株和疫苗株的双重RT-PCR检测方法。特异性试验显示,该检测方法对猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、Salmonella及E.coli等结果均为阴性;敏感性试验显示,所建立的双重PCR检测方法对M基因和ORF3基因的最低有效检测量分别为44.5拷贝/μL和481拷贝/μL。本研究建立的双重RT-PCR检测方法可实现对PEDV野毒和疫苗毒的快速检测,适合于现地猪流行性腹泻的鉴别诊断。     

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立

猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)已经成为养猪行业的主要疫病。建立能够同时检测且能区分这2种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PEDV和PDCoV基因序列,分别用PDCoV M基因和PEDV M基因设计了2对引物,并对PEDV的M基因片段和PDCoV的M基因片段进行扩增,通过对PCR反应条件的优化,建立了检测PDCoV和PEDV双重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。特异性和敏感度的试验表明,此方法对PDCoV和PEDV核酸的最低检测量分别为3.27×10~3拷贝/μL和3.63×10~4拷贝/μL,具有较高的敏感度;该方法可同时扩增出340 bp(PDCoV)和520 bp(PEDV),但不能扩增出猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪博卡病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。多重PCR与单一PCR符合率100%。表明此方法可以用于PDCoV和PEDV的检测。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因设计LAMP引物,对反应体系的条件优化并进行特异性及敏感性等试验。结果显示:该方法在60℃下恒温扩增60min,使PEDV的M基因得到了高效率特异性扩增。本试验方法特异性好,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRSSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)等无交叉反应,同时也具有较好的灵敏性,最低检测分子拷贝数为1.0×102 copies/μL。反应结束后加入SYBR GreenⅠ在紫外灯下观察颜色变化,结果显示阳性扩增产物呈现绿色荧光。结果表明:该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作便捷,适于临床检测PEDV。     

猪博卡病毒3/4/5型PCR检测方法的建立及应用

通过分析GenBank上登录的猪博卡病毒3/4/5型(PBoV3/4/5型)基因序列,发现这些基因序列中存在一段高度同源性保守序列,针对该序列设计并合成1对引物,成功建立了可同时扩增出PBoV 3/4/5型的PCR检测方法。对2013年8月至2014年5月河南省50份临床腹泻仔猪小肠样品进行检测,结果 21份为PBoV阳性,阳性率为42%,表明PBoV在河南省猪群中存在一定流行。本试验建立的PCR方法对PBoV3/4/5的检测具有简便、快速、灵敏度高和特异性强的特点,为PBoV 3/4/5型的快速检测提供了有效的技术支持。     

猪博卡病毒1/2型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速和高通量检测猪博卡病毒(PBoV)的方法,本研究根据GenBank中登录的PBoV 1/2型NS1基因高度同源保守序列设计并合成一对特异性引物,建立了检测PBoV1/2的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。结果表明,该方法对常见的其它病毒均未检测到荧光信号,而仅对PBoV1/2检测为阳性;其灵敏度为45拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;组内和组间变异系数均小于5%。本实验建立的荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,为PBoV的早期诊断和定量分析PBoV感染程度提供参考。     

猪博卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的猪博卡病毒(PBoV)序列,通过VP1/2基因设计引物和Taq Man探针建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法与PPV、PRRSV及PCV均无交叉反应,具有较高特异性,在107 copies/mL～101 copies/mL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.997,最低可检测到101copies/mL的阳性质粒。说明所建立的PBoV实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好和精确性高等优点。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用

本实验建立猪博卡病毒(PBoV)PCR检测方法,并调查当前云南猪群中PBoV的感染情况。在GenBank数据库中对PBoV全基因组序列进行比对分析,找出保守序列,设计1对扩增PBoV非结构蛋白NP1基因片段的引物,基于该引物建立PBoVPCR检测方法;用所建立的方法检测发生腹泻猪的粪便,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;以提取的PCV2、大肠杆菌的DNA为模板验证引物的特异性;并用核酸蛋白定量仪定量PBoV阳性样本的DNA,经梯度稀释后取1μL为模板确定所建立的PBoVPCR方法的敏感性;应用建立的PCR方法调查140份2015年云南省部分猪群样品中PBoV的存在情况。本实验建立的PCR方法特异性强,仅能扩增出PBoV,对PCV2、大肠杆菌核酸无交叉扩增现象;灵敏度高,对PBoV的最低可检出DNA浓度为0.1ng/μL;应用建立的PCR方法检测了140份采集自云南省部分地区的粪便样品,结果显示样本中PBoV的检出率为20%(28/140)。实验成功建立了检测PBoV的PCR方法,对云南地区猪群PBoV的临床诊断和流行病学调查等具有参考价值。     

副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立基于SYBR Green Ⅰ的快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的实时荧光定量PCR方法,参照GenBank公布的HPS的infB基因序列(DQ:781933.1),设计特异性引物;提取HPS基因组,进行PCR扩增,回收目的片段;构建阳性标准模板,建立标准曲线;验证其敏感性、重复性和特异性。结果显示,本试验得到了阳性标准质粒,并建立了标准曲线,线性关系在102copies/μL～108copies/μL检测范围内良好;该方法敏感性达到10copies/μL,比常规PCR高100倍,重复性试验变异系数均小于2.5%,同时对HPS具有良好的特异性。结果表明,本试验建立的副猪嗜血杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法可用于临床对HPS的快速诊断和定量检测。     

非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法的建立

为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)核酸的荧光PCR方法,试验根据GenBank中ASFV的p72基因和PCV2的ORF1基因序列,分别设计特异性引物,通过对加样体系和扩增程序的优化,建立了检测ASFV和PCV2的双重SYBR GreenⅠ荧光PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价,最后对收集的临床样品进行检测。结果表明,最终确立的20μL反应体系中各引物最佳添加量为：F1 0.7μL、R1 1.0μL、F2 0.8μL和R2 1.5μL;优化后的扩增反应程序为：95℃预变性3 min; 94℃变性5 s, 54℃退火20 s (此处收集荧光),40个循环。该方法具有很好的特异性,不与其他常见猪病原体发生交叉反应。检测ASFV和PCV2的灵敏度分别可达5.6 copies/μL和3.2 copies/μL,T_m值的批内和批间变异系数均不高于1.0%,对14份临床样品的检测结果与参比方法一致。本研究所建立ASFV和PCV的双重SYBR GreenⅠ荧光PCR方法敏感性高,特异性好,可用于临床2种疾病的快速检测。     

猪口蹄疫病毒MFIA xTAG检测方法的建立

为了提高猪口蹄疫病毒诊断准确性,针对口蹄疫病毒的3D基因建立了FMDV的xTAG检测方法。根据3D基因序列设计特异引物,上游引物5’端加TAG序列,下游引物5’端加生物素,进行PCR扩增,扩增产物与荧光编码微球和SA-PE杂交,在Luminex 200检测仪上读数。用所建立的MFIA xTAG检测方法进行特异性、灵敏度、重复性及病料样品的检测。结果表明,该方法的特异性强;检测的敏感性可达1×10~2 copies/μL;批内、批间的变异系数都在3%以下;检测结果与SYBR Green I荧光PCR方法100%相符。表明建立的液相基因芯片方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于猪口蹄疫病毒的检测。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立及应用

根据GenBank登录的猪流行性腹泻病毒株FJ473395的M基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出182 bp的片段。产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,产物Tm在85～85.5℃之间,灵敏度为5.875拷贝/μL,特异性和重复性较好。本试验建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断,并定量分析PEDV感染程度奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速鉴别诊断,根据PEDV的N基因和TGEV的S基因序列设计引物,并以猪β-肌动蛋白(ACTB)作为内参对照,建立了PEDV和TGEV的TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法。结果显示：该方法对PEDV、TGEV和ACTB的检测灵敏度分别为1、10和10 copies/μL;PEDV和TGEV敏感度为10^0.02 TCID₅₀和10^0.05 TCID₅₀,高于常规RT-PCR,批内和批间变异系数均小于1%。与猪德尔塔冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪轮状病毒、乙型脑炎病毒、塞内卡谷病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型均无交叉反应。采集124份临床病料样品进行检测,PEDV阳性率为42.74%,TGEV阳性率为8.87%,检测结果与该病毒单一荧光RT-PCR方法的检测结果均一致,证明该方法具有较高特异性和敏感性,可用于PEDV和TGEV临床病料检测。     

尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立

根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101copies/μL~4.6×108 copies/μL和5.8×101copies/μL~5.8×108 copies/μL,检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用该方法对236份猪的鼻拭子样品进行NiV和SIV的同时检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,有1份样本的SIV检测结果为阳性。本研究建立的方法可为猪临床样本中NiV和SIV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

四川部分地区新生仔猪病毒性腹泻的病原学诊断

根据参考文献合成5对针对猪传染性腹泻病毒(PEDV)M基因、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因、猪轮状病毒(PRV)VP4基因、博卡病毒(PBoV)VP1/VP2基因、猪库布病毒(PKoV)3D基因,可分别特异扩增出大小为467 bp、1 062 bp、750bp、496bp和323 bp的DNA片段的特异性引物,对四川部分地区2011年10月至2012年5月新生仔猪腹泻病例样本进行RT-PCR、PCR检测和透射电镜观察。检测结果显示,SC1、SC2猪场的病例样本均扩增出PKoV 3D基因特异性DNA片段,均未扩增出TGEV、PRV、PBoV的特异性DNA片段,仅SC1猪场有1份样本扩增出PEDV M基因的特异性DNA片段。测序结果表明,扩增出的PKoV 3D基因特异性DNA片段大小为323 bp,与GenBank登录序列同源性均在95%以上;扩增出的PEDV M基因特异性DNA片段大小为467 bp,与GenBank登录序列同源性均在98%以上。透射电镜观察结果显示,两个猪场样本均可见有直径大小为25、30 nm的球形病毒颗粒。结果显示,此次四川部分地区猪场发生的病毒性腹泻病例均存在PKoV感染,说明PKoV与此次疫情有紧密联系。