NEFA和BHBA对体外培养的脂肪细胞HSL、ADPN mRNA表达的影响

在体外培养的牛脂肪组织和脂肪细胞中,分别添加5个浓度梯度的NEFA和BHBA,均设3个重复,通过荧光定量PCR技术,观测不同浓度的NEFA和BHBA对牛脂肪细胞ADPN mRNA与HSL mRNA丰度的影响。结果表明:NEFA在一定浓度范围内(0.2~0.8 nmol/L)对ADPN mRNA表达有显著促进作用并呈剂量依赖性,而高浓度(>1.6 nmol/L)时又显著下调其表达;0.2~0.8 nmol/L NEFA对HSL mRNA的表达有抑制作用,呈剂量依赖性,但在高浓度时(>0.8 nmol/L)反而促进了其表达(P<0.05)。低浓度的BHBA对HSL mRNA的表达无显著抑制作用,高浓度(1.2 mmol/L)的BHBA显著下调HSL mRNA的表达,并呈剂量依赖性;低浓度(<0.6mmol/L)的BHBA对ADPN mRNA的表达无明显作用,但高浓度的BHBA(>0.6 mmol/L)对ADPN mRNA的表达具有明显的抑制作用(P<0.05)。结论:代谢中间产物可通过促进ADPN mRNA或抑制HSL mRNA的表达来调节脂肪代谢。     

BHBA对体外培养牛肝细胞氧化应激状态及抗氧化关键酶活性和mRNA表达的影响

评价氧化应激状态有助于理解奶牛代谢紊乱性疾病(如酮病等)的发病机制.本研究以牛肝细胞体外培养模型为基础,通过细胞培养液中添加不同浓度的β-羟丁酸(BHBA),运用分光光度方法和实时荧光定量PCR(realtime PCR)技术,分别测定细胞裂解上清液中过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)的含量、总抗氧化能力(TCA)和过氧化氢酶(CAT)、总谷胱甘肽过氧化物酶(T-GSH-Px)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性,以及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mRNA表达水平的变化.结果显示,随着BHBA浓度的增加,肝细胞中H2O2和MDA的含量呈剂量依赖性增加,添加BHBA 24 h后,各组H2O2和MDA的含量均显著高于0、12和48 h.各时间点TCA含量随添加BHBA浓度的增加而降低.添加BHBA 12 h后,低浓度组(0.6mmol/L BHBA)T-SOD、T-GSH-Px和CAT的活性及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mRNA表达均显著高于对照组,高浓度组(1.2和2.4mmol/L BHBA)T SOD、T-GSH-Px和CAT的活性及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mRNA表达均低于对照组;添加BHBA 24、48h后,T SOD、T-GSH-Px和CAT的活性及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mR-NA表达均随BHBA浓度的增呈剂量依赖性抑制.结果表明,添加低浓度的BHBA可以维持体外培养肝细胞中氧化抗氧化系统的动态平衡,但高浓度BHBA影响该动态平衡,导致肝细胞处于氧化应激状态,引起氧化应激损伤,进而影响肝细胞的正常生理功能.     

NEFA对体外培养的牛脂肪组织HSLmRNA和ADPNmRNA丰度的影响

脂联素(ADPN)是脂肪组织基因表达的蛋白质产物之一,脂联素的蛋白酶水解产生的球状头部区域(gAcrP30)可以降低高脂试验餐和静脉注射脂肪乳剂产生的血浆非酯化脂肪酸,可以增加组织细胞内甘油三酯(TG)含量,脂质代谢障碍时血浆脂联素浓度下降[1-3],可见脂联素参与了脂肪代谢.但代谢中间产物NEFA对脂肪细胞HSLmRNA 和ADPNmRNA表达的影响目前尚不清楚.     

胰岛素对体外培养牛肝细胞胰岛素受体mRNA水平的影响

在新生牛单层肝细胞培养液中添加胰岛素,其浓度分别为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L和100μmol/L,处理12h,应用半定量RT-PCR方法研究胰岛素对体外培养新生牛单层肝细胞胰岛素受体(IR)mRNA水平的影响.结果表明随胰岛素浓度的升高,肝细胞IRmRNA丰度呈下降趋势,指示肝细胞内IRrnRNA丰度下降以调节胰岛素浓度.     

不同激素对体外培养犊牛肝细胞LDLR mRNA表达量的影响

本研究旨在从分子水平上部分阐述不同激素对体外培养犊牛肝细胞低密度脂蛋白受体(LDLR)mRNA表达量的影响。选取一头健康的初生犊牛,放血致死后立即无菌采取肝脏尾状突,采用循环灌注法消化肝组织,分离肝细胞。取接种于6孔培养板中生长良好的肝细胞,分别添加1、10、100、1 000 nmol/L的胰岛素,1、10、100、1 000 nmol/L的胰高血糖素,2.5、5.0、10、50 ng/m L的瘦素,设置空白对照,每个浓度3个重复。采用荧光定量PCR分析LDLR mRNA的表达量。结果表明:胰岛素各浓度添加组LDLR mRNA表达量极显著高于对照组(P0.01),但是1、10 nmol/L添加组间差异不显著(P0.05);胰高血糖素1 000 nmol/L添加组LDLR mRNA表达量极显著低于对照组(P0.01),10、100 nmol/L添加组显著低于对照组(P0.05),其余各组间差异不显著(P0.05);瘦素各添加组间差异不显著(P0.05)。试验结果证明,胰岛素对LDLR mRNA的表达有促进作用,且随着胰岛素浓度的增加,促进作用加强;胰高血糖素对LDLR mRNA的表达有抑制作用,且随着胰高血糖素浓度的增加,抑制作用加强;瘦素未表现出对LDLR mRNA的表达有促进或者抑制作用。     

代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞MTP mRNA表达的影响

为了阐明代谢产物在奶牛肝脂蛋白组装与转运过程中的调控作用,通过向体外培养的新生犊牛肝细胞添加非酯化脂肪酸(NEFA)、β-羟丁酸(BHBA)和葡萄糖,采用内对照RT-PCR方法检测代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞MTP mRNA丰度的影响。结果显示,随着培养液中NEFA和葡萄糖浓度的升高,MTP mRNA的丰度呈现剂量依赖性上调(P<0.01);随着BHBA浓度的增加,MTP mRNA的丰度先升高后降低(P<0.01或P<0.05)。结果表明,NEFA和葡萄糖对肝细胞MTP mRNA表达具有促进作用,呈剂量依赖性:BHBA对肝细胞MTP mR-NA表达具有低剂量促进高剂量抑制的双重作用。     

神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞MTP mRNA表达的影响

为了阐明神经内分泌因子在奶牛肝脂蛋白组装与转运过程中的调控作用,通过向体外培养的新生犊牛肝细胞添加胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白,采用内对照RT-PCR方法检测神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)mRNA丰度的影响。结果显示,随着细胞培养液中胰岛素和胰高血糖素浓度升高,MTP mRNA的丰度呈现剂量依赖性下降(P<0.01);随着瘦蛋白浓度的增加,MTP mRNA的丰度先升高后降低(P<0.01或P<0.05)。这表明胰岛素和胰高血糖素对肝细胞MTP mRNA表达具有抑制作用,呈现剂量依赖性;瘦蛋白对肝细胞MTP mRNA表达具有低剂量促进而高剂量抑制的双重作用,且均呈现剂量依赖性。     

葡萄糖对体外培养的牛脂肪细胞HSL mRNA和ADPN mRNA丰度的影响

在体外牛脂肪细胞培养介质中分别添加0,5,10,15,20,25 mmol/L等不同梯度的葡萄糖,各浓度组均设置3个重复,应用荧光定量PCR技术,观测不同浓度的葡萄糖对体外单层培养的牛脂肪细胞脂联素（ADPN）mRNA与甘油三酯脂肪酶（HSL）mRNA丰度的影响。结果表明,葡萄糖可抑制牛脂肪细胞ADPN mRNA的表达,并促进HSL mRNA的表达。     

瘦蛋白对体外培养的新生牛脂肪细胞Ob-Rb mRNA表达的影响

取单层生长良好的脂肪细胞，采用单因素试验，分别添加浓度为5ng／mL外源牛重组瘦蛋白（每12h添加1次）不添加作为对照至4、12、24、36、48和72h后提取总RNA，每个处理3个重复（孔），应用竞争RT-PCR法检测外源瘦蛋白对初生犊牛脂肪细胞Leptin长型受体（Ob—Rb）表达水平的影响，结果与对照组相比在12～24h内随着培养时间的增加，脂肪细胞Ob—Rb表达水平量亦显著增加（P〈0．01），之后其表达量逐渐回降，在48～72h趋于平稳（P〉0．05）。结果表明，在一定时间内瘦蛋白可提高体外培养的新生牛脂肪细胞Ob-Rb mRNA的表达水平。     

胰岛素胰高血糖素对体外培养牛脂肪细胞HSL mRNA和ADPN mRNA丰度的影响

动物体内脂肪的沉积过程是脂肪细胞不断分化和细胞内脂肪不断合成、蓄积的过程.脂肪细胞在分化过程中除形态学发乍变化外,细胞内也发生一系列复杂的生物化学变化,因此,脂肪细胞的分化在动物体脂肪沉积的调控过程中起着重要作用[1].     

重组牛抵抗素对体外培养肝细胞PEPCK活性的影响

为了探讨重组牛抵抗素对体外培养肝细胞PEPCK活性的影响,取72h培养良好的肝细胞培养板(6孔板),每孔分别接种重组牛抵抗素0,10,50,100,300,500ng/L(共6个梯度,每个梯度6个重复),继续培养12h,收集上清,采用乳酸脱氢酶偶联比色法测定PEPCK活性。结果显示,PEPCK酶活性随重组牛抵抗素浓度的升高而增强,10ng/L以上的重组牛抵抗素可明显提高PEPCK活性,这表明牛抵抗素具有生物学活性,能提高PEPCK活性。     

应用竞争PCR检测丙酸盐对体外培养牛肝细胞丙酮酸羧化酶mRNA水平的影响

根据牛肝细胞内PC(丙酮酸羧化酶)基因组与PCcDNA相比多含有一个内含子序列．在其中再插入一外源DNA序列．从而使最终构建的突变体片段的长度大于PCcDNA的长度，成功构建了PCcDNA的竞争DNA模板，然后应用竞争PCR方法研究了丙酸盐对体外培养新生牛单层肝细胞PCmRNA水平的影响。使单层肝细胞培养液中丙酸钠浓度分别为0、1．5、2．5、3．5、4．5、8．5、11．5mmol／L，处理24h，提取总RNA、逆转录，在同一体系中用相同引物扩增目的带和竞争模板带。结果表明．随着丙酸钠浓度的升高．PCmRNA水平呈上升趋势，提示肝细胞内PCmRNA的表达水平受培养液中丙酸钠浓度的影响。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养犊牛肝细胞CPT-Ⅰ和CPT-ⅡmRNA表达的影响

体外原代培养犊牛肝细胞,添加不同浓度的胰岛素（insulin,INS）（0、1、10、100、1 000nmol/L）和胰高血糖素（glucagon,GLN）（0、1、10、100、1 000nmol/L）,每个处理做3个重复,分别培养1h后,提取总RNA。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法,检测肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅰ）和肉碱棕榈酸转移酶Ⅱ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅱ）mRNA表达的变化。结果显示,随着培养液中INS含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量逐渐降低,呈现一定的剂量依赖性。随着培养液中GLN含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量均升高,呈现一定的剂量依赖性,且当GLN的添加浓度高于100nmol/L时,CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量显著升高（P〈0.01）。结果表明,INS可在一定程度上抑制脂氧化关键酶的表达,GLN可显著促进脂氧化关键酶的表达。     

瘦素对体外培养肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明瘦素（Leptin）在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用,应用RT-PCR法观察了瘦素对体外培养肝细胞胰高血糖素受体（GLNR）mRNA丰度的影响。结果发现,随着培养液中瘦素浓度的升高,GLNR mRNA的表达呈现先升高后降低的趋势（p〈0.01）;研究结果表明瘦素直接调控奶牛肝胰高血糖受体mRNA的表达。     

乙酸和β－羟丁酸对体外培养牛肝细胞脂代谢部分关键酶表达的影响

本研究以体外原代培养的奶牛肝细胞为模型,添加不同浓度的乙酸（AcOH）和p羟丁酸（BHBA）,探讨其对奶牛肝细胞脂肪酸代谢关键酶基因表达的影响。添加不同浓度乙酸和β－羟丁酸,培养24h后,提取细胞总RNA。应用实时荧光定量PCR方法,检测脂代谢关键酶长链脂酰辅酶A合成酶1（ACSLl）、柠檬酸合成酶（CS）和乙酰辅酶A羧化酶α（ACCα）mRNA丰度的变化。结果显示,适当浓度的AcOH能够促进肝细胞脂肪酸活化及氧化途径关键酶ACSLl和CS的转录,而高浓度AcOH能够抑制脂肪酸从头合成途径关键酶ACCα的转录;高浓度BHBA能够抑制肝细胞ACSLl、CS和ACCα的转录。说明血液中适当浓度的AcOH能够促进肝脏脂肪酸氧化并抑制脂肪酸从头合成,高浓度BHBA能够抑制肝脏脂氧化和合成,影响乳脂前体物的供应,进而影响乳脂合成。     

乙酸和β-羟丁酸对体外培养牛肝细胞脂代谢部分关键酶表达的影响

以体外原代培养的奶牛肝细胞为模型,添加不同浓度的乙酸（Aceticacid,AcOH）和β-羟丁酸（β-hydroxybu—tyrate,BHBA）共培养24h后,提取细胞总RNA。应用实时荧光定量PCR方法检测脂代谢关键酶长链脂酰辅酶A合成酶1（Long-chain acyl-CoA synthetase-1,ACSL1）、柠檬酸合成酶（Citrate synthase,CS）和乙酰辅酶A羧化酶α（Acetyl coenzyme A carboxylase α,ACCα）mRNA丰度的变化。结果显示,适当浓度的AcOH能够促进肝细胞脂肪酸活化及氧化途径关键酶ACSL1和CS的转录,而高浓度AcOH能够抑制脂肪酸从头合成途径关键酶ACCa的转录;高浓度BHBA能够抑制肝细胞ACSL1、CS和AcCα的转录。结果表明,血液中适当浓度的AcOH能够促进肝脏脂肪酸氧化并抑制脂肪酸从头合成,高浓度BHBA能够抑制肝脏脂氧化和合成,影响乳脂前体物的供应,进而影响乳脂合成。     

脂联素对体外培养新生牛脂肪细胞ADPN、HSL mRNA表达的影响

取单层生长状态良好的犊牛脂肪细胞,分别添加0、2.5、5、15、30、50、100 μg/mL外源牛重组脂联素（adiponectin,ADPN）,培养12 h后提取总RNA,采用荧光定量PCR方法检测外源脂联素对脂肪细胞ADPN mRNA和HSL mRNA表达水平的影响。结果显示,随着ADPN添加量的增多,ADPN mRNA相对表达量呈下降趋势;添加ADPN 15 μg/mL时,HSL mRNA的表达量达到峰值,之后呈下降趋势。结果表明体外培养的脂肪细胞中ADPN mRNA表达量受自身的负调节,而添加适量的ADPN可刺激脂肪细胞HSL mRNA的表达。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养的牛脂肪细胞HSL mRNA和ADPN mRNA丰度的影响

试验在单层培养的新生犊牛脂肪细胞中,分别添加胰岛素（INS）与胰高血糖素（GN）,每个激素设置6个梯度3个重复,通过荧光定量PCR技术,观测2种激素对ADPN mRNA与HSL mRNA丰度的影响。结果表明,胰岛素抑制了脂肪细胞ADPN mRNA与HSL mRNA的表达,胰高血糖素促进了ADPN mRNA与HSL mRNA的表达,且ADPNmRNA与HSL mRNA存在相关性。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养肝细胞DGAT2mRNA的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素、胰高血糖素在奶牛脂肪代谢过程中的调控作用,用荧光定量PCR方法检测胰岛素、胰高血糖素对肝细胞二酰基甘油酰基转移酶（DGAT2）mRNA丰度的影响。结果表明低浓度的胰岛素能促进脂肝细胞内DGAT2mRNA的表达;胰高血糖素抑制脂肝细胞内DGAT2mRNA表达。由此证明：胰岛素和胰高血糖素能直接调控肝细胞中的DGAT2基因mRNA的表达。