初情期启动过程中小尾寒羊下丘脑GnRH基因甲基化状态及表达量关系研究

初情期启动的早晚关系到雌性动物的繁殖性能,GnRH是动物初情期启动过程中的关键基因,其启动子区甲基化状态与GnRH mRNA表达量之间的关系尚不清楚。本研究选择初情期前、临近初情期和初情期雌性小尾寒羊的下丘脑作为样本,利用亚硫酸氢盐测序(BSP)技术和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了初情期不同阶段小尾寒羊GnRH启动子区的甲基化状态和GnRH mRNA的表达量,并分析二者之间的关系。结果表明:小尾寒羊到达初情期时,GnRH基因启动子区甲基化水平显著降低(P0.05),尤其是在启动子区-570位点降低最明显,而随着初情期的启动GnRH mRNA表达量呈上升趋势。结果提示,初情期启动过程中,GnRH mRNA表达量升高可能与下丘脑GnRH基因启动子区特定位点甲基化水平降低存在一定的关系。     

初情期启动过程中MeCP2和GnRH在母羊下丘脑的分布定位

本实验旨在研究甲基化CpG结合蛋白(MeCP2)和促性腺激素释放激素(GnRH)初情期启动过程中在母羊下丘脑的分布及二者关系。选取初情期前、临近初情期和初情期阶段雌性小尾寒羊各3只,采集下丘脑,利用免疫荧光双标记技术研究MeCP2和GnRH在母羊下丘脑视前区(POA)和弓状核(ARC)中的分布。结果表明:MeCP2和GnRH在下丘脑ARC和POA均有分布,且呈现共表达模式,ARC中共表达阳性细胞数在初情期显著高于初情期前期和临近初情期(P0.05),POA中共表达阳性细胞数初情期显著低于初情期前期和临近初情期(P0.05)。结果提示,MeCP2可能通过调控下丘脑GnRH的表达而参与母羊初情期启动的调控。     

多浪羊CNP基因克隆及其在初情期组织表达特性分析

【目的】 克隆多浪羊C型利钠肽(CNP)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在多浪羊初情期启动前后下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中的表达规律,以期为研究CNP基因在多浪羊初情期启动过程中的作用机制提供参考。【方法】 参考GeneBank中绵羊CNP基因的序列(登录号:XM_027974523.1)设计引物,以初情期前、初情期、初情期后的多浪羊为试验对象,采用RT-PCR技术扩增多浪羊CNP基因并进行克隆测序;用DNAMAN软件同其他物种进行相似性比对,并使用Mega 5.0构建系统发育树。用生物信息学软件分析CNP基因的核苷酸序列及其编码蛋白的疏水性、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域等理化性质和二级结构、三级结构信息;用实时荧光定量PCR技术检测多浪羊下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中CNP基因的表达量。【结果】 多浪羊CNP基因序列大小为2 227 bp,其中包括5'-UTR 50 bp、3'-UTR 914 bp和CDS区1 263 bp。相似性比对和系统发育树结果显示,多浪羊与山羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远;多浪羊CNP基因共编码420个氨基酸,其编码蛋白是亲水性蛋白质,无跨膜结构域和信号肽。多浪羊CNP蛋白的二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲;三级结构预测显示CNP蛋白无配体结构;实时荧光定量PCR结果显示,在初情期启动的3个发育阶段,下丘脑中CNP基因表达量显著高于其他组织(P<0.05);初情期下丘脑中CNP基因的表达量显著低于初情期前(P<0.05);子宫中初情期前CNP基因的表达量显著高于初情期和初情期后(P<0.05)。【结论】 本研究成功克隆了多浪羊CNP基因,其主要在下丘脑和子宫中表达;在初情期前、初情期、初情期后的发育过程中,下丘脑组织中CNP基因的表达量先降低再升高,提示CNP基因可能在初情期的启动过程中参与调控。     

Dnmt1和GnRH在母羊初情期启动过程中下丘脑的分布定位

本文旨在研究DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)和促性腺激素释放激素(Gonadotropin Releasing hormone,GnRH)在母羊初情期启动过程中的表达、分布及两者关系。选取初情期前、临近初情期和初情期阶段雌性小尾寒羊各3只,采集其下丘脑,利用免疫荧光双标记技术研究Dnmt1和GnRH在母羊下丘脑视前区(Preoptic area,POA)和弓状核(Arcuate nucleus,ARC)中的表达和分布。研究表明,Dnmt1和GnRH在下丘脑ARC和POA均有表达,且呈现共表达模式,ARC中共表达阳性细胞数在初情期显著高于初情期前期(P 0. 05),POA共表达阳性细胞数在初情期显著降低(P 0. 05)。结果提示,Dnmt1可能通过调控下丘脑GnRH的表达而参与母羊初情期启动的调控。     

Lin28B基因表达与绵羊初情期启动的关系研究

初情期是家畜从不能繁殖到获得繁殖能力的标志,是雌性动物发育过程中的一个关键阶段。研究以性早熟的多浪羊和性晚熟的和田羊为研究对象,对其Lin28B基因外显子3进行克隆,采用Real-time PCR技术分析Lin28B基因在多浪羊和和田羊幼年期、初情期下丘脑、卵巢中表达变化,结果显示多浪羊和和田羊Lin28B基因外显子3序列相同,多浪羊下丘脑和卵巢中Lin28B基因mRNA表达量在初情期时低于幼年期(P0.05);和田羊卵巢Lin28B基因mRNA表达量在初情期时低于幼年期(P0.05)。研究结果表明,Lin28B基因表达下调与初情期启动呈正相关,该研究对于揭示Lin28B基因在绵羊初情期启动中的作用及机制提供了科学依据。     

Kiss-1/GPR54系统在不同发育阶段五指山猪下丘脑中的表达

采用荧光定量技术研究Kiss-1mRNA和GPR54mRNA在30、60、90(初情期)和120日龄五指山母猪下丘脑表达情况,并检测血清中FSH、LH、E2、P4浓度变化。结果表明:初情期前,Kiss-1mRNA表达量随着五指山猪年龄的增长逐渐升高,到初情期(90日龄)时表达量达到最高(P0.05),120日龄(初情期后)时表达量逐渐降低(P0.05)。GPR54mRNA表达不受影响。血清FSH、LH、E2、P4浓度变化的趋势大体一致,初情期前各激素水平逐渐升高,但差异不显著(P0.05);至初情期(90日龄)时显著升高,且达到一个峰值;血清FSH、LH和E2浓度在90日龄和120日龄时差异不显著(P0.05),P4浓度在90日龄时显著高于120日龄(P0.05)。结果显示:Kiss-1基因是五指山猪初情期启动的关键因子。     

多浪羊PROKR2基因克隆、生物信息学及组织差异表达分析

【目的】克隆多浪羊促动力素受体2(prokineticin receptor 2,PROKR2)基因,并检测初情期启动过程中PROKR2基因在多浪羊不同组织中的表达水平,为探究PROKR2基因在绵羊初情期启动过程中的作用提供依据。【方法】以初情期后多浪羊下丘脑cDNA为模板,PCR扩增PROKR2基因并克隆测序。利用DNAMAN软件对测序结果进行拼接,采用MegAlign软件进行物种间相似性比对并构建系统进化树,并利用生物信息学软件预测多浪羊PROKR2蛋白理化性质和结构功能。使用实时荧光定量PCR技术检测PROKR2基因在多浪羊下丘脑、垂体、卵巢、输卵管及子宫中初情期前、初情期及初情期后的表达水平。【结果】克隆获得PROKR2基因序列大小为2 641 bp,包括5′-UTR 143 bp、3′-UTR 1 343 bp和CDS区1 155 bp,编码384个氨基酸,与GenBank中绵羊预测mRNA序列(登录号：XM＿004014342.5)相似性为99.83%。系统进化树表明,多浪羊PROKR2基因的遗传距离与山羊最近,与鸡最远。生物信息学分析表明,PROKR2蛋白为疏水稳定碱性蛋...     

梅山与长大母猪下丘脑-垂体-卵巢轴Kiss1和GPR54基因的表达差异

研究早熟与晚熟品种母猪下丘脑-垂体-卵巢轴Kiss1和GPR54基因的表达差异。选用8头梅山母猪与12头长大(LY)母猪为研究对象,梅山母猪于70 d和100 d屠宰,LY母猪于70、100 d和199 d屠宰,收集血清及下丘脑、垂体、卵巢组织样品。ELISA检测血清瘦素(Leptin)和雌二醇(E2)水平,PCR克隆梅山与LY母猪Kiss1基因编码序列,实时荧光定量PCR检测母猪下丘脑、垂体、卵巢组织Kiss1和GPR54基因表达水平。结果表明:梅山与LY母猪Kiss1基因编码序列相似性为100%;梅山与LY母猪初情期下丘脑Kiss1基因表达量极显著高于垂体与卵巢(P<0.01),卵巢GPR54基因表达水平显著高于下丘脑与垂体(P<0.05)。梅山母猪下丘脑-垂体-卵巢轴Kiss1基因表达水平都显著高于相同日龄和初情期LY母猪(P<0.05),梅山母猪血清Leptin水平极显著高于相同日龄LY母猪(P<0.01)。而E2水平显著高于100 d与初情期LY母猪(P<0.01)。Leptin与下丘脑Kiss1和GPR54基因表达呈显著正相关(P<0.05),而E2仅与下丘脑Kiss1基因表达有极显著正相关关系(P<0.01);梅山与LY母猪Kiss1基因编码区序列相似性为100%,梅山母猪下丘脑-垂体-卵巢轴上kiss1基因表达量较LY母猪高,主要原因可能是初情日龄早,下丘脑Kiss1基因表达水平的高低与血清Leptin和E2浓度密切相关。     

发情周期不同阶段KiSS-1和GPR54 mRNA在小尾寒羊卵巢上表达规律的研究

研究发情周期不同阶段KiSS-1和GPR54 mRNA在小尾寒羊卵巢中的表达规律,为从分子水平阐明小尾寒羊多胎性的奠定基础。将12只雌性小尾寒羊随机分为4组,分别处于发情前期、发情期、发情后期和间情期,每组3只,颈动脉放血致死后采集卵巢,采用实时荧光定量PCR技术研究发情周期不同阶段母羊卵巢上KiSS-1和GPR54基因的表达规律。结果表明:母羊发情周期各阶段卵巢上均有KiSS-1和GPR54基因表达;发情期母羊卵巢KiSS-1基因的表达量显著提高(P<0.01),比发情后期、间情期和发情前期分别提高了1.0、1.7倍和1.4倍,发情周期不同阶段GPR54基因在卵巢上的表达量无显著差异(P>0.05)。研究结果表明,发情期母羊卵巢上KiSS-1基因的表达量极显著高于发情周期其他阶段,提示卵巢上KiSS-1表达可能参与母羊排卵过程的调节。     

多浪羊Lin28A基因克隆及其在初情期启动过程中的表达研究

旨在克隆绵羊Lin28A基因cDNA序列,探讨其在初情期启动过程中的表达规律和调控特性。本研究分别在初情期前(第1次发情前1周)、初情期、初情期后(第1次发情后1周)屠宰多浪羊各5只。采集下丘脑、垂体、卵巢组织,对其Lin28A基因cDNA进行克隆,利用DNAman 6.0软件对多浪羊Lin28A氨基酸与其他物种的Lin28A氨基酸序列进行同源性比较。采用Real-time PCR技术分析下丘脑、垂体、卵巢中Lin28A基因、let-7a、let-7b在初情期启动过程中表达的变化规律。结果表明,多浪羊Lin28AcDNA序列为3 581bp,包括2 963bp的3′UTR和618bp CDS;多浪羊Lin28A氨基酸与人、家鼠、牛和绵羊的同源性分别是87.56%、88.52%、92.68%和89.95%,与鸡、斑马鱼的同源性分别是76.10%、61.84%。在初情期前至初情期的过程中,下丘脑、卵巢中Lin28A表达显著降低(P<0.05),let-7a、let-7b的表达没有显著变化(P>0.05)。本研究结果对于揭示Lin28A基因在绵羊初情期启动中的作用及机制提供了科学依据。     

金川多肋牦牛Hoxa6和Hoxa10基因甲基化与mRNA差异表达研究

本研究旨在通过检测金川多肋牦牛与普通牦牛中Hoxa6和Hoxa10基因的转录水平和启动子区甲基化状态,为揭示Hox基因在金川多肋牦牛多1对肋骨性状形成中的转录调控机制奠定基础。通过实时荧光定量PCR技术检测Hoxa6和Hoxa10基因在多肋牦牛和普通牦牛中的mRNA表达水平,同时采用重亚硫酸盐测序PCR(Bisulfite-sequencing PCR,BSP)法对Hoxa6和Hoxa10启动子区进行甲基化修饰与克隆测序,分析甲基化状态。结果显示,多肋牦牛中Hoxa6基因表达量显著高于普通牦牛(P0.05),而Hoxa10基因表达量显著低于普通牦牛(P0.05)。Hoxa6启动子区域的CpG2,在普通牦牛中的DNA甲基化显著高于多肋牦牛(P0.05),尤其是第3、4、8、20和21位CpG位点;Hoxa10启动子区域的CpG1在普通牦牛中的DNA甲基化状态显著低于多肋牦牛(P0.05),普通牦牛的第9和12位CpG位点几乎未甲基化。多肋牦牛中Hoxa10高甲基化在一定程度上抑制了Hoxa10基因的表达,Hoxa6低甲基化水平促进了Hoxa6基因的表达。启动子区域的甲基化在一定程度上影响Hox基因的转录调控,且与多肋性状的形成可能存在一定的联系。     

陆川猪GPR1基因启动子甲基化及其mRNA表达分析

为了探讨G-蛋白偶联受体1(GPR1)基因启动子甲基化对其在陆川猪和杜洛克猪背最长肌组织中差异表达的影响,试验采用实时荧光定量PCR方法检测GPR1基因mRNA在两个品种猪背最长肌中的表达水平,在线预测的方法预测GPR1基因启动子区CpG岛,亚硫酸氢盐测序(BSP)法分析猪GPR1基因启动子区CpG岛的甲基化水平。结果表明:GPR1基因在两品种猪背最长肌组织中的相对表达量差异显著,在陆川猪背最长肌中的相对表达量明显高于杜洛克猪;GPR1基因启动子区存在一个CpG岛,长度为103 bp,位于-1 031~-929 bp处;GPR1基因启动子区CpG岛在两品种猪背最长肌中的整体甲基化水平差异不显著,但在-126,-116,-64,-10位点甲基化水平差异显著。说明GPR1基因启动子甲基化程度与肌内脂肪沉积存在一定关联。     

多浪羊NPTX1基因克隆、生物信息学分析及在初情期的表达研究

【目的】试验旨在克隆多浪羊神经元正五聚体蛋白1(neuronal pentraxin 1,NPTX1)基因CDS序列,利用生物信息学分析NPTX1蛋白的结构和功能,并研究其在多浪羊初情期启动过程中性腺轴不同组织中的表达规律。【方法】采集初情期前、初情期、初情期后健康雌性多浪羊的下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫组织,提取总RNA并反转录成cDNA,以初情期前下丘脑cDNA为模板,PCR扩增多浪羊NPTX1基因并克隆测序,对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析NPTX1基因在多浪羊下丘脑、垂体、卵巢、子宫、输卵管5个组织中的表达水平。【结果】克隆得到NPTX1基因长1 576 bp,其中CDS区序列为1 299 bp,与GenBank上预测的绵羊mRNA序列(登录号：XM＿005683183.3)相似性达99.85%。系统进化树分析得出,多浪羊NPTX1基因与绵羊的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。生物信息学分析发现,NPTX1蛋白为不稳定的亲水性酸性蛋白,具有1个信号肽,属于分泌蛋白;二级结构中α-螺旋和无规则卷曲占比分别为41.90%和40.73%,与三级结构预测结果一致。...     

gabra1基因在小梅山猪和苏姜猪下丘脑中表达量的比较

用荧光定量方法对不同日龄小梅山猪和苏姜猪下丘脑中gabra1基因的表达进行了研究。结果发现:小梅山猪和苏姜下丘脑gabra1 mRNA表达丰度的变化,从初生到初情期逐渐升高,初情期后下降;小梅山猪不同发育阶段间差异显著(P<0.05),苏姜猪初生与180日龄间差异不显著(P>0.05),其余各阶段间差异显著(P<0.05)。小梅山猪初生、初情期、初情后三个发育阶段下丘脑gabra1mRNA表达丰量均显著高于苏姜猪(P<0.05)。     

苏太断奶仔猪TAP1基因启动子区甲基化修饰与F18大肠杆菌抗性的关系

本试验运用亚硫酸氢盐(BSP)+Miseq测序法分析苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型和敏感型个体十二指肠和空肠组织TAP1基因启动子区的甲基化水平,并运用real-time PCR(RT-PCR)方法检测TAP1的m RNA表达量,进而分析TAP1基因启动子区甲基化修饰对m RNA表达的影响,探讨TAP1基因启动子区甲基化修饰对F18大肠杆菌抗性的调控作用。结果表明:TAP1基因启动子区2个Cp G岛及其中间区域内存在28个Cp G位点,且都存在不同程度的甲基化;其中在Cp G-6位点,抗性型个体空肠组织中的甲基化水平显著低于敏感型个体的甲基化水平(P0.05);在Cp G-7和Cp G-8位点,抗性型个体十二指肠组织中的甲基化水平显著高于敏感型个体的甲基化水平(P0.05);Cp G-7和Cp G-8位点甲基化水平与TAP1基因m RNA表达量呈负相关。本实验结果显示,Cp G-6、Cp G-7和Cp G-8是调控基因转录水平的关键性位点,断奶仔猪可能通过对TAP1基因启动子区Cp G岛这些关键位点的去甲基化来提高十二指肠和空肠组织中m RNA的表达水平,进而发挥对E.coli F18抗性的调控作用。     

小尾寒羊高繁殖力候选基因ESR在同期发情处理过程中的表达分析

试验选择高繁殖力小尾寒羊为试验动物,采用公认的CIDR结合外源激素处理使其同期发情,与自然发情及乏情的小尾寒羊作对比,利用反转录荧光定量RT-PCR和Western blotting技术研究雌激素受体(estrogen receptor, ESR)基因在卵巢细胞中的表达差异,同时对其启动子区的甲基化岛进行了分析。结果发现,自然发情绵羊和外源激素处理发情的羊在发情表现和时间上无明显差别;在转录水平的检测结果上也无显著性差异(P＞0.05);但是它们显著高于在乏情期绵羊卵巢细胞内的表达(P＜0.05)。尽管激素处理的同期发情羊卵巢细胞内的ESR蛋白表达量显著高于乏情期绵羊,但是仍然显著低于自然发情期绵羊卵巢细胞的表达(P＜0.05)。此外,自然发情和激素处理的绵羊ESR基因启动子区CpG岛甲基化水平分别为0和10.77%,而发情期绵羊ESR基因启动子处于超甲基化状态（92.30%）。以上结果说明,外源激素处理的同期发情小尾寒羊尽管发情表现、时间等与自然发情的绵羊类似,但是ESR基因在蛋白水平上差异显著,且其启动子区CpG岛甲基化水平也存在显著性差异,这也许是目前胚胎移植后着床率低下的原因之一。     

BMPR-IB基因对羔羊初情期及血清褪黑激素分泌水平的影响

为分析多胎萨福克新品系肉羊的繁殖特点,以及BMPR-IB基因对初情期多胎萨福克羔羊褪黑激素分泌的影响,应用PCR-RFLP方法检测多胎萨福克羔羊BMPR-IB基因的多态性,应用公羊试情和外阴外观变化确定母羔初情期,用ELISA方法测定初情期前后母羔血清中褪黑激素的含量,分析BMPR-IB基因不同基因型母羔初情前期、初情期、初情后期褪黑激素分泌水平的变化。结果表明:多胎萨福克羊群体中BMPR-IB基因存在++、B+和BB三种基因型,平均初情期179 d,不同基因型母羔初情期时间差异不显著(P0.05);褪黑激素在初情期分泌水平较高,初情前后的4个时间点分泌出现波动,但没有达到显著性水平(P0.05),BMPR-IB基因不同基因型羔羊血清中的褪黑激素含量差异不显著(P0.05)。说明BMPR-IB基因的突变没有引起初情期多胎萨福克羔羊褪黑激素分泌水平的显著变化。     

DNA甲基化在奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎中的调控

旨在研究CSN1S1基因启动子区上游STAT5结合区域的DNA甲基化在奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎中的变化及其对CSN1S1基因表达的调控.本研究利用亚硫酸氢盐修饰和荧光定量PCR法检测受金黄色葡萄球菌侵染后12、24、36和196 h乳腺组织CSN1S1基因启动子区上游甲基化程度及CSN1S1基因表达量.结果,24 h内在细菌侵染的乳腺组织中甲基化程度随着时间的延长而增加；而CSN1S1基因表达量则显著降低(P＜0.01),而在侵染后36和196 h,甲基化程度和基因表达水平与24 h无显著差异.结果表明,奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎能够促使乳腺组织DNA再甲基化,DNA再甲基化可能是奶牛乳房炎急性期的一种普遍调控.     

Smad1基因在敖汉细毛羊发情不同时期卵巢中的表达规律研究

为了探索Smad1 mRNA及其蛋白在敖汉细毛羊不同发情时期卵巢中表达量的变化规律,试验采用实时荧光定量PCR、免疫组化方法分析绵羊不同繁殖状态下(乏情期、发情间期、发情前期、发情期)Smad1基因在卵巢中mRNA表达量的变化规律及卵巢中该基因蛋白的表达,并进行图像分析。结果表明:发情期Smad1基因表达量最高,极显著高于其他三个时期(P0.01);发情前期Smad1基因表达量显著高于乏情期和发情间期(P0.05)。在绵羊不同发情时期Smad1蛋白主要表达于乏情期原始卵泡、次级卵泡的颗粒细胞、发情间期次级卵泡的卵泡膜细胞,在发情前期与发情期卵泡中未见表达。卵巢中Smad1基因可能促进黄体溶解,对卵泡发育、卵子的成熟以及释放起作用,与绵羊发情的启动有一定关系。     

DNA甲基化与雌性动物初情期的关系

在雌性动物的生命活动中,繁殖能力具有很重要的作用和意义,而繁殖能力的高低和初情期的发生密切相关。营养、环境与激素共同调控雌性动物初情期的发生,但这些调控的基础是遗传因素,不同基因在不同时期的表达影响着雌性动物初情期的开始。近年的研究发现,表观遗传学在动物发育过程中也起到至关重要的作用,其中DNA甲基化在影响雌性动物初情期方面具有很重要的影响,直接影响基因的表达,从而调控初情期的发生,为初情期调控机制的研究提供了新的方向。因此,本文主要介绍DNA甲基化与初情期的关系,阐明DNA甲基化在雌性动物初情期中的作用,为进一步研究DNA甲基化对动物初情期的调控机制提供基础和依据。