木质素合成关键酶咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶的研究进展

木质素是植物次生细胞壁的主要组分,其合成涉及多个酶的参与。其中咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶（caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase,CCoAOMT）是植物木质素合成中的一个关键酶,能催化咖啡酰辅酶A（caffeoyl-CoA）生成阿魏酰辅酶A（feruloyl-CoA）,主要参与G-木质素的合成。本文综述了CCoAOMT的特征、功能及其在木质素生物合成中的调控作用,展望了该基因的研究方法及其在生产中的应用。     

胡麻Δ9硬脂酰ACP脱氢酶(SAD2)基因的表达分析

为了改良胡麻油脂肪酸组分,通过半定量RT-PCR方法对Δ9硬脂酰ACP脱氢酶(SAD2)基因在胡麻蒴果不同发育阶段的表达情况进行了分析。结果表明,在开花后20 d的蒴果中表达量最高,在成熟期时表达量显著降低。据此认为,开花后20 d可能是不饱和脂肪酸积累的关键时期。通过对SAD2基因的表达分析,为进一步通过基因工程育种手段改良胡麻油品质建立基础。     

朗德鹅3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMGCS1)cDNA克隆及其mRNA在填饲鹅肝组织中表达的研究

本实验旨在获得鹅(Anser anser)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMGCS1)的cDNA序列,观察该基因的表达与填饲鹅肝脏生成胆固醇的相关性。选用填饲28 d朗德鹅作为实验材料,运用RACE方法扩增目的基因的cDNA序列,利用荧光定量PCR技术检测并分析HMGCS1基因在各组织中mRNA的表达,比较填饲28 d后各组织HMGCS1基因表达的变化,同时选用胆固醇试剂盒测定鹅肝中胆固醇的含量。结果显示,HMGCS1基因的cDNA全长为2 947 bp,开放阅读框编码522个氨基酸(GenBank登录号:KF425515)。荧光定量PCR结果显示,该基因在肝脏中表达显著高于其他组织(P0.05)。填饲28 d后,填饲组肝脏胆固醇含量低于对照组(P0.05),该基因在肝脏中的表达显著降低(P0.05)。氨基酸序列分析表明,HMGCS1基因高度保守,与鸭(Anas platyrhynchos)、鸡(Gallus gallus)、鸽子(Columba livia)等家禽同源性较高。该基因特异性地在肝组织中表达,且该基因的表达与肝脏中胆固醇合成呈正相关。本实验结果为进一步研究HMGCS1基因的功能提供了参考资料。     

奶山羊ELOVL6基因启动子的克隆及活性区域分析

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)主要催化C12～C16饱和或单不饱和脂肪酸的延伸,是长链脂肪酸延长反应的限速酶.本研究根据云南黑山羊(Capra hircus)的基因组序列(Gene ID:NW_005100691.1)设计引物,以血液DNA为模板,利用PCR技术扩增得到西农萨能奶山羊(C.hircus)ELOVL6基因启动子的全长序列,通过缺失分析,构建了10个包含ELOVL6启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,与海肾荧光素酶对照报告基因载体(pRL-TK)共同转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性.结果表明,克隆得到ELOVL6基因启动子全长序列2 370 bp(包含转录起始位点上游2 168 bp),其与牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)的基因组序列同源性分别为94％、81％和80％,LO VL6启动子上无典型的真核生物启动转录元件TATA框.缺失突变研究发现,ELOVL6基因启动子前端存在负调控元件,启动子核心区域位于转录起始位点上游109～40 bp,该序列包含过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisom prolifeator-activated receptor,PPAR)、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白-1 (sterol-regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)及核因子Y(nuclear factor Y, NF-Y)等转录因子的结合位点,本研究为ELOVL6基因启动子的功能研究提供理论依据.     

家蚕3-羟酰辅酶A脱氢酶基因全长cDNA克隆及其在质型多角体病毒感染家蚕的差异表达

家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）是家蚕的重要病毒病原之一,往往给养蚕业生产造成极大危害。我们以前的研究运用基因芯片技术在感染质型多角体病毒的家蚕中肠中鉴定出一个差异表达的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因（Bombyx mori3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase protein gene-Bm3HAD）。本研究利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆了该基因,其全长cDNA序列为1168bp,包含一个83bp5＇端非翻译区序列（5＇-UTR）、一个930bp的开放阅读框（ORF）和一个155bp的3＇端非翻译区序列（3＇-UTR）;基因结构分析发现该基因由5个外显子和4个内含子组成。RT-PCR结果显示该基因在家蚕中肠、脂肪体、血液、丝腺及生殖体中均有表达。荧光定量PCR结果表明该基因在BmCPV感染初期为上调表达,随着病毒感染的进展,该基因的表达水平逐渐降低,并转变为下调表达。研究结果为进一步研究BmCPV对家蚕致病的分子机制提供了有益的信息。     

不同肉牛品种中乙酰辅酶A:二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT1)遗传多态性及对胴体性状的影响

本研究采用PCR-SSCP方法研究了3个黄牛(Bos taurus)品种(鲁西牛、晋南牛和秦川牛)及4个杂交肉牛(夏洛莱×鲁西牛、安格斯×鲁西牛、利木赞×鲁西牛和西门塔尔×鲁西牛)群体乙酰辅酶A:二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT1)第17 exon和3'UTR的多态性.在3'UTR有5个碱基突变位点,分别位于8 402 bp(C→T)、8 414 bp(A→C)、8 445 bp(T→C)、8 465 bp(A→G)和8 545 bp(G→A),并且8 402 bp处碱基突变属首次发现.x2检验的结果表明,在该基因座位7个群体均处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05或P<0.01).经DUNCAN'S检验表明在该基因座位上BB基因型个体的宰前体重、胴体重、眼肌面积、膘度和日增重均显著高于CC基因型的个体,而CC基因型个体的大理石花纹、背膘厚度和肌内脂肪含量均显著高于BB型个体.研究表明,DGAT1基因的等位基因B与肉牛的眼肌面积等胴体性状相关,等位基因C与大理石花纹、背膘厚度、肌内脂肪含量等肉质性状相关.     

填饲对朗德鹅SCD5、SREBP2和ELOVL6甲基化和mRNA表达的影响

DNA甲基化是表观遗传学的研究热点之一.为了探索填饲是否能够引起朗德鹅Anser anser)肝脏脂类代谢中DNA甲基化水平以及基因表达量的变化和DNA甲基化修饰作用和基因表达之间的关系.本研究运用焦磷酸测序技术分析鹅肝脏硬脂酞辅酶A去饱和酶5基因(stearovl-CoA desaturase 5,SCD5)、固醇调节元件结合蛋白2基因(sterol regulatory element-binding protein 2,SREBP2)和超长链脂肪酸延伸酶6基因(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)的甲基化水平,再运用qRT-PCR技术进行定量验证.结果显示,SCD5、SREBP2和ELOVL6各2个片段的甲基化水平均在20％以上,均属于高甲基化状态;对照组3个基因各2个片段的甲基化水平均高于填饲组,填饲组与对照组的SCD5-1S和SREBP2-1S片段甲基化差异显著(P＜0.05),SREBP2-2S片段甲基化差异极显著(P＜0.01),SCD5-2S、ELOVL6-1S和ELOLV6-2S片段甲基化差异不显著(P＞0.05);填饲组SCD5和ELOVL6的mRNA表达量均高于对照组,而SREBP2在填饲组的mRNA表达量显著低于对照组(P＜0.05).综合各项指标,填饲引起鹅肝脏组织SCD5、SREBP2和ELOVL6甲基化水平降低,SCD5和ELOVL6 mRNA表达量上升,SREBP2的mRNA表达量降低,表明SCD5和ELOVL6的甲基化修饰对mRNA的表达起反向调控的作用.本实验结果为表观遗传学上DNA甲基化研究方法提供参考,为选育鹅肥肝高产高质系提供重要的分子遗传学依据,也为人类肥胖症和脂肪肝等代谢疾病的研究提供理论依据.     

苦瓜Ⅲ型过氧化物酶Prxs基因及其启动子的克隆与表达分析

过氧化还原蛋白(Prxs)是广泛存在于植物体内重要的抗氧化酶。为深入研究Prx基因在苦瓜非生物胁迫中的作用,从苦瓜叶片均一化文库中获得McPrx基因的cDNA全长序列,并命名为McPrx(KJ722768.1),该cDNA序列全长1 068 bp,开放阅读框972 bp,编码324个氨基酸,属于ClassⅢ基因家族成员。采用基因组步移法分离获得McPrx基因5'上游1 237 bp的启动子调控序列,运用Plant CARE对其进行顺式作用元件分析,结果显示该序列除含有CAAT-box、TATA-box等核心启动子元件,还具有激素、抗病与抗逆应答元件,表明McPrx基因的表达可能受多种外界环境条件的调控。qRT-PCR分析表明,McPrx在根、茎、雌花等器官中的表达量存在极显著差异。其中在茎中表达量最大,在雌花中表达量最低,说明该基因的表达具有器官表达特异性;低温胁迫1 h时,McPrx表达量显著上调,胁迫3 h时McPrx表达量达到最大,随后下降,说明McPrx响应了低温胁迫的应答。本研究结果为进一步研究McPrx的生物学功能及其应用奠定了基础。     

缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因(ω3FAD)在酿酒酵母中的低温诱导表达

ω3 脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase, FAD)能使藻类细胞产生一系列具有高附加值的ω3 脂肪酸。在已克隆到缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl)的ω3FAD 基因基础上,为进一步了解其功能,本研究首先利用反转录 PCR(RT-PCR)技术,克隆其开放阅读框(open reading frame, ORF)片段,然后亚克隆到穿梭表达载体 pYES2 中,以构建重组酵母表达载体 pY-ω3FAD;通过电穿孔法将该重组载体转入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSc1 菌株中,经筛选与序列验证得到含有 pY-ω3FAD 重组质粒的酵母转化株。在 5℃,添加底物亚麻酸及半乳糖诱导表达,连续培养 72 h,经脂肪酸甲酯的气相色谱分析及气相色谱 - 质谱联用证明,转目的基因的酵母能将外源添加的亚油酸在 15 位脱氢生成α- 亚麻酸,表明ω3FAD具有Δ15 脂肪酸去饱和作用的功能。在不同温度条件下诱导培养时,气相色谱结果显示,在 30℃培养的转基因酵母中没有检测到α- 亚麻酸;但在不高于 25℃培养的转基因酵母中,发现ω3FAD 能将外源添加的底物去饱和为α- 亚麻酸,且随着温度的降低,其去饱和能力增强,5℃时的底物转化效率达到29.73%。将转目的基因酵母在 5℃温度下诱导培养不同时间,结果显示,随着培养时间的增加,LA(linoleic acid,亚油酸)转化为α- 亚麻酸的效率也提高,培养 4 d 时其转化效率达到 38.86%。该研究结果提示,缺刻缘绿藻ω3FAD 基因编码的酶蛋白为一个低温诱导酶。缺刻缘绿藻ω3FAD 基因之所以能在酵母细胞中被低温诱导表达,可能因为后者存在一个低温诱导的脂肪酸去饱和系统。     

鹅3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)基因内含子5的SNP及其与鹅重要经济性状的关联性

屠宰测定了116只皖西白鹅(Anser anser)杂种一代鹅(母本为四川白鹅(A.anser))的胴体性状、羽绒性状和肉质性状,克隆了鹅3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)基因内含子5,PCR-SSCP检测其SNP,并分析了SNP与鹅重要经济性状之间的关联性。结果显示,鹅HMGR基因内含子5长704bp,与鸡的同源性44.0%;PCR-SSCP检测发现,内含子5存在1个SNP位点,带有1对等位基因A和B,其基因频率分别为0.7716和0.2284。分析不同基因型与性状的关联性表明,AA型对提高鹅胸肌重和腺胃重(P<0.05),增加胸肌纤维直径和羽绒的千朵重(P<0.01),以及降低胸肌45pH和绒系水率(P<0.05)具有显著的遗传效应;AB型的遗传效应则与AA型相反。     

猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)启动子克隆及其分析

本研究旨在对猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)的转录调控机制进行初步探讨.首先通过PCR方法扩增MC4R基因5’上游启动区l 234 bp(-1 264～-31 bp)的片段,再利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,最后采用步移缺失获得了11段长度不等的启动子片段,并分别克隆到荧光素酶(LUC)报告基因表达质粒(pGL3-Basic)中.同时,通过双荧光素酶报告活性分析检测MC4R基因启动子区不同长度片段在猪上皮型肾细胞(PK15)中瞬时转染后的活性.结果表明,猪MC4R 5’端-682 bp处存在1个潜在的转录起始位点(TSS),细胞检测结果显示-514～-486bp区域内存在控制MC4R基础转录活性的顺式调控元件,推测该序列内的热休克转录因子(HSF)结合位点可能对MC4R基因的表达调控及功能行使具有重要作用.     

猪FUT1基因启动子区的确定及活性分析

F18大肠杆菌(Escherichia coli F18,E.coli F18)是养猪(Susscrofa)业中发生最普遍、危害最大的病原菌之一,球系列鞘糖脂生物合成通路及通路中α-(1,2)岩藻糖转移酶1基因(alpha(1,2)fucose transferase 1,FUT1)对断奶仔猪F18抗性具有重要调控作用.本研究运用生物信息学技术挖掘课题组前期获得的断奶仔猪转录组测序结果,确定FUT1基因的转录起始位点和启动子区.同时对启动子区序列进行CpG岛分析;采用双荧光素酶报告基因以及AliBaba 2.0软件,分别分析启动子区活性和CpG岛序列潜在的转录结合位点.通过比对人类(Homo sapiens)和猪的基因序列信息数据库,结果表明,FUT1基因转录起始区域具有5种可变剪接(AS-1,AS-2,AS-3,AS-4和AS-5)和2个启动子区域(启动子1和启动子2);双荧光素酶报告基因检测结果进一步显示,FUT1基因启动子2的转录活性极显著高于启动子1的转录活性(P＜0.01),启动子2的活性是启动子1的2.75倍,根据结果可以推测启动子2在转录过程中起主导作用;CpG岛分析显示,猪FUT1基因启动子1和启动子2分别存在一个CpG岛.FUT1启动子1扩增片转录因子预测分析表明,FUT1基因启动子1存在20个潜在的转录因子结合位点,并且Sp1出现在多个转录结合位点处.本研究结果为猪FUT1基因的甲基化检测和调控机制分析提供一定的基础和依据.     

水稻rbcs基因启动子的克隆及结构功能分析

利用PCR法克隆了水稻日本晴来源的核酮糖-1、5-二磷酸羧化酶小亚基基因（rbcS）5’上游调控区，命名为Posrbcs。将Posrbcs与gus基因融合，并通过农杆菌介导转入水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性进行定性与定量分析，结果表明，Posrbcs启动子可驱动gus基因在转基因水稻植株的叶片、叶鞘、茎杆及颖壳中特异性表达，在胚乳中不表达。然后构建不同长度片断的Posrbcs的5’端缺失体，分别与gus构建融合基因，转入水稻中。对转基因植株GUS活性定量分析结果显示， Posrbcs片段愈短，GUS活性愈低；进一步的光诱导试验结果显示，光能明显提高gus基因表达活性，并且随着Posrbcs片段缩短，Posrbcs中的I box、GT1结合位点、GATA box、T box 等光诱导相关元件的缺失会造成在不同时间段的光诱导活性降低以及光诱导表达时间后移。凝胶阻滞试验证实Posrbcs序列中的这些光诱导相关元件有相应的核蛋白的结合。     

玉米赤霉烯酮降解酶基因（ZEN-jjm）的克隆、表达及活性分析

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是世界上污染范围最广泛的一种镰刀霉毒素,能导致人或动物不孕、流产等症状,损害内脏器官并促进癌细胞的生长.本文通过设计1对特异性引物,从粉红螺旋聚孢霉(Gliocladium roseum)中克隆获得大小为795 bp的DNA片段(ZEN-jjm),通过构建E. coil原核表达载体进行表达.经HPLC检测证实,IPTG诱导后的细胞裂解上清能在3 h内完全降解液体中1μg/mL的ZEN.序列分析结果表明ZEN-jjm与zhd101存在9个碱基的差异,ZEN-jjm编码的ZEN降解酶与文献报道的乳糖水解酶存在3个氨基酸的差异,但ZEN毒素降解实验证实二者活性相似.     

牛白细胞介素1受体相关激酶2（IRAK2）基因的克隆及生物信息学分析

Toll样受体 (toll-like receptors,TLRs)可识别病原体相关分子模式,通过下游信号转导激活免疫细胞,在天然免疫和适应性免疫应答中起着重要的作用,而白细胞介素1受体相关激酶2(interleukin-1 receptor-associated kinase 2,IRAK2)为TLRs信号转导通路下游重要的分子,起着信号转导与调控作用。为了深入研究牛TLRs信号转导通路对牛病原体所致疾病抗性中的主要作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆了牛IRAK2基因的cDNA和进行了基因表达谱分析,并对其基因序列和所编码的蛋白质的结构特征进行了生物信息学分析。结果表明,牛IRAK2基因在乳腺、肝、十二指肠、脂肪、子宫、肾、心、肺、胰和卵巢10个组织中有表达,其序列全长为2 148 bp(GenBank登录号为EU528620),包括36 bp的5'非翻译区（1~36）,1 866 bp的CDS区（37~1 902）和246 bp的3'非翻译区（1 903~2 148）,编码622个氨基酸,其分子量为68 628.31 D,等电点为5.3。IRAK2蛋白含有一个DD结构域和一个S_TKc结构域,位于细胞核、细胞质、线粒体和质膜上,通过DD和S_TKc结构域对TLRs的信号转导有着重要的作用。     

水曲柳SnRK2B基因和启动子的克隆及分析

为了研究水曲柳中同源SnRK2转录因子的功能,在水曲柳干旱响应转录组中寻得SnRK2B的同源序列并克隆得到SnRK2B转录因子基因全长,将其命名为FmSnRK2B。使用SiteFinding-PCR法扩增获得SnRK2B启动子序列,并对FmSnRK2B基因编码区及其启动子进行生物信息学分析和启动子顺式调控元件分析。结果表明,克隆得到的全长序列包含完整的开放阅读框1074bp,编码357个氨基酸。启动子顺式作用元件分析结果表明,其启动子区包含脱落酸应答元件ABRE及胁迫相关元件HSE、MBS等。干旱胁迫下,FmSnRK2B基因的表达随胁迫时间的延长先增加后降低,表明其参与植株的抗逆过程。本研究对进一步揭示水曲柳的抗逆机制具有重要意义。     

小金海棠类黄色条纹蛋白基因(MxYSL5)启动子的克隆与表达

为探明小金海棠(Mdus xiaojinensis)类黄色条纹蛋白基因(MxYSL5)的表达和调控机制,应用Tail-PCR技术从小金海棠中克隆了翻译起始位点上游891 bp的启动子序列.生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件、乙烯应答元件、赤霉素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件.以GFP为报告基因,构建了含MxYSL5基因启动子的植物表达载体MxYP5-GFP.将MxYP5-GFP用基因枪法转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞,瞬时表达结果表明,该启动子能够驱动GFP在洋葱表皮细胞中的表达,可以用于MxYSL5的表达示踪.     

猪Nramp1基因启动子克隆及其组织表达活性分析

Nramp1基因在猪肺泡巨噬细胞中具有较高的组织表达特异性,本研究的目的是克隆并分析猪(Sus scrofa)Nramp1基因在肺泡巨噬细胞中的特异性表达调控元件.本研究首先利用5'RACE技术确定了Nramp1基因转录起始位点,在此基础上构建了-1 327～+86 bp区域内不同长度的嵌套缺失片段,分别连接至pGL3-BASIC载体上,构建了pLUC1430、pLUC1136、pLUC840、pLUC751、pLUC487、pLUC379、pLUC274及pLUC179共8个缺失表达载体.采用脂质体转染法,与海肾荧光素酶载体共转染猪肺泡巨噬细胞、肾细胞、脂肪前体细胞和胎儿成纤维细胞,采用双荧光素酶报告系统验证了Nramp1基因不同启动子片段的表达活性,结果表明Nramp1基因核心启动子区位于-386～-173 bp.进一步比较了pLUC487[-386～+86]启动子区在巨噬细胞、猪肾细胞、脂肪细胞和胎儿成纤维细胞中的表达活性,结果表明Nramp1基因在巨噬细胞中的表达活性极显著地高于肾细胞、脂肪细胞和成纤维细胞(P<0.01),表明Nramp1基因启动子具有较高的巨噬细胞特异性.本研究获得了能够在猪肺泡巨噬细胞中特异表达的调控元件,为进一步实现外源基因在猪肺泡巨噬细胞中的特异性表达提供了基础.     

小金海棠Fe3+-螯合还原酶MxFRO2基因启动子的克隆与表达分析

通过染色体步移法从小金海棠（Malus xiaojinensis）基因组中克隆了三价铁螯合还原酶（ferric chelate reductase, MxFRO2）基因翻译起始位点上游1 738 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件G-box、生长素应答元件、铜元素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。从TAIR网站获得了拟南芥（Arabidopsis thaliana）中8个FRO基因上游的启动子序列,通过PlantCARE分析了其与MxFRO2启动子的异同。根据在线预测结果,克隆了翻译起始位点上游1 644 bp（MxFul）和259 bp（MxD1）两段序列,构建了其与GFP融合的瞬时表达载体,并将重组质粒通过PEG介导法分别转化拟南芥叶片原生质体,结果表明,小金海棠MxFul和MxD1两段启动子序列都能驱动GFP蛋白在拟南芥原生质体中的瞬时表达。