蟹源副溶血弧菌胞外蛋白酶的纯化与特性分析

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Cellulose离子交换柱层析等方法,从中华绒螯蟹Eriocheir sinensis弧菌病病原菌——副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的胞外产物中分离纯化出两种具有致病作用的胞外蛋白酶。相对分子质量为39 600的蛋白酶是一种金属蛋白酶,EDTA可抑制其活性,金属离子Cu2+、Mg2+、Fe2+对该酶有抑制作用,而Ca2+对其则有一定程度的激活作用;该酶在50⁶0℃下热稳定性最好,最适pH为9。而相对分子质量为20 000的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,EDTA对其酶活力几乎没有影响,但苯甲基磺酰氟(PMSF)可抑制其酶活性;该酶的最适温度为50℃,最适pH为8。     

嗜水气单胞菌胞外蛋白酶ECPase54的纯化及特性分析

嗜水气单胞菌（Ａｈ）Ｊ－１株的液体培养物上清在５６℃或与乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）或丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）作用，其胞外蛋白酶（ＥＣＰａｓｅ）的活力有不同程度的下降，将酪蛋白掺入丙烯酰胺聚合后，加Ａｈ－Ｊ－１上清作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ３７℃原位消化，染色，显示上清中存在至少５种分子量不同的蛋白酶，ＡｈＪ－１株的培养上清经硫酸铵沉淀，ＤＥＡＥ－纤维素离子交换层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２０     

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆及原核表达

根据GenBank上已有的副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列,设计并人工合成引物.将耐热直接溶血毒素的基因全长克隆到大肠杆菌表达载体pGEX- 4T-1上,构建重组表达载体tdhA/pGEX- 4T-1和tdhS/pGEX- 4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达的工程菌株.优化诱导表达条件,表达耐热直接溶血毒素.转化有重组质粒tdhA/pGEX- 4T-1,tdhS/pGEX- 4T-1的BL21可稳定高效地表达可溶形式的目的蛋白.表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,用GST琼脂糖珠柱亲和层析纯化.溶血实验表明,表达的蛋白具有溶血活性.     

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的急性毒性研究

为研究耐热直接溶血毒素(TDH)对实验小鼠的急性毒性,经腹腔注射实验小鼠不同浓度梯度的TDH(42.0、19.5、9.1、4.2和1.9mg·kg~(-1)体重,对照组设为PBS),连续观察14d,记录各组小鼠的死亡情况及生理反应。实验终止时进行大体解剖,摘取心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏观测脏器指数,断尾采血并计数血细胞。结果表明,TDH对昆明种小鼠的半数致死量LD_(50)为11.0 mg·kg~(-1)体重,小鼠的死亡主要集中发生在注射TDH后的72 h内,并且伴随着腹泻现象。各组存活的实验小鼠在注射TDH后的第5天后,精神状态基本恢复,正常进食进水。各组小鼠脏器未见明显炎症反应,小鼠血液中红细胞与白细胞数量也未见统计学差异。TDH的毒性靶器官是心脏、肺、肾脏、脾脏、胃和肠。TDH对小鼠的半数致死量和毒性靶器官及病理学表现可为TDH的进一步实际应用及研究提供科学的依据和资料。     

绵羊瘤胃微生物胞外蛋白酶的动态及纯化

本实验用装有永久性瘤胃瘘管的成年新疆细毛羯羊3只,对饲喂前后瘤胃蛋白酶活性的变化规律及瘤胃液离心各组分的酶活比例进行测定,并对离心(12000转/min,30min,4℃)后的瘤胃上清液中的微生物胞外蛋白酶进行纯化。结果表明:①瘤胃蛋白酶活性在饲喂后3h左右最高,以后逐渐下降,至饲喂后8h左右恢复到饲喂前的水平。②瘤胃液中以游离形式存在的蛋白酶占40％,其余附着在微生物和饲料颗粒上。③用硫酸铵对上清液中的微生物胞外蛋白酶进行浓缩,依次经SephadexG—150、DEAE—Sephadex A—50和FPLC(Mono Q HR5/5柱)进行纯化后,得到电泳纯度的胞外蛋白酶品,其活力从1.77个单位/mg蛋白提高到295个单位/mg蛋白,提高了166.7倍,回收率为4.7％。SDS—PAGE测得纯化蛋白酶的分子量为38KD。     

虾源副溶血弧菌致病基因检测与ERIC-PCR分型

为了监测上海市养殖对虾中副溶血弧菌致病基因的携带情况及潜在致病株流行情况,采用PCR方法对上海地区不同对虾养殖单位中分离获得的19株副溶血弧菌分离株及1株标准菌株进行6种致病基因的检测筛查,并采用ERIC-PCR方法进行基因分型分析。结果发现:19株副溶血弧菌中未检测出携带tdh、ORF8基因,只有1株携带trh基因,而tox RS/new基因携带率较高,19株中有14株检出阳性,基因携带率为73.7%。对能够引起对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的副溶血弧菌特异性质粒基因的检测中发现,AP1和AP2基因均有3株检测出阳性,基因携带率均为15.8%。通过ERIC-PCR分型技术将20株副溶血弧菌分成7个不同的类群,其分辨力指数DI值为0.811,表明ERIC-PCR具有较好的基因分型能力,分型结果发现该方法能够有效区分不同时间段获得的菌株,而对不同地理位置获得的菌株区分并不明显。以上结果表明从养殖对虾中分离得到的副溶血弧菌致病基因携带率总体偏低,但存在一定的流行风险,需要防范一些新的致病株的流行,这些可以为对虾养殖单位中副溶血弧菌致病流行株的预防控制提供相关参考。     

广州市售水产品副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐药性评估

[目的]研究广州市售水产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐药性情况。[方法]采用Kirby-Bauer纸片扩散法检测从水产品中分离的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌对水产养殖业中常用的18种抗生素的耐药情况。[结果]水产品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌均对万古霉素、克林霉素以及青霉素类抗生素有明显抗性,多重耐药比例达100%,溶藻弧菌的多重耐受现象较为突出。[结论]广州市售水产品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌具有多种抗生素抗性,且多重耐药情况突出。     

水稻纹枯病菌胞外蛋白酶分离纯化及部分特性分析

[目的]为深入研究水稻纹枯病菌的致病机理奠定基础。[方法]水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solaniKhn）发酵液经硫酸铵沉淀,用离子交换柱层析、疏水层析和分子筛层析方法分离纯化胞外蛋白酶。[结果]从水稻纹枯病菌发酵液中分离纯化到一个分子量约为49.5ku的胞外蛋白酶。其活性最适温度为30℃,最适pH为6.4。Zn^2＋、Fe^3＋、Cu^2＋对酶活性有抑制作用,Mg^2＋、Mn^2＋对酶活性无影响,Ca^2＋在低浓度下对酶活性有激活作用。[结论]水稻纹枯病菌可产生胞外蛋白酶,该胞外蛋白酶与水稻纹枯病菌致病性的关系还有待深入研究。     

应用斑点ELISA技术检测副溶血弧菌

研究了应用斑点酶联免疫吸附试验(Dot-Enzym e L inked Immunosorbent Assay,Dot-ELISA)技术检测副溶血弧菌Vibrio parahaem olyticus的方法。根据棋盘试验,确定副溶血弧菌免疫血清最佳工作浓度为1∶200,酶标抗体最佳工作浓度为1∶100,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,副溶血弧菌呈阳性,哈维氏弧菌V.harveyi、嗜水气单胞菌Aerom onas hydrophila、河流弧菌Vf.luvialis biotype、溶藻弧菌V.alginolyticus、大肠杆菌Escherichia coli均呈阴性。斑点ELISA方法不仅具有快速、经济的特点,而且可用肉眼直接判定结果,适合在基层单位应用推广。     

抗副溶血弧菌IgY的提纯及检测副溶血弧菌的间接ELISA的建立

分离纯化抗副溶血弧菌IgY,并建立一种快速检测副溶血弧菌的间接酶联免疫吸附法(indirect ELISA),分析了该方法的敏感性、特异性和重复性. 将水稀释法、乙醇沉淀法和DEAE-Sepharose FF离子交换层析联用以分离纯化抗副溶血弧菌IgY,然后以纯化的IgY为一抗,辣根过氧化物酶标兔抗鸡IgY为二抗,建立检测副溶血弧菌的间接ELISA方法. 结果表明:建立的间接ELISA方法,一抗的最佳工作质量浓度为15 μg/mL,二抗的最佳稀释度为1∶ 10 000,副溶血弧菌培养液的检出限为1.0×105 cfu/mL,该方法对测定的其他8种菌株没有交叉反应. 建立的间接ELISA方法具有良好的灵敏度、特异性和稳定性,能够快速、准确地对副溶血弧菌进行检测.     

中华绒螯蟹血细胞cDNA文库的构建及质量初检

为了筛选中华绒螯蟹Eriocheir sinensis血细胞免疫的相关基因,促进蟹类免疫防治的进展,采用Gubler-Hoffman法构建了中华绒螯蟹血细胞的cDNA文库。结果表明：该文库初始滴度为4.50×106cfu/mL,库容为3.3×106cfu/mL,重组率为73%,插入片段大小多为800~2 500 bp。随机挑取了94个重组子进行测序初检,共得到93条平均长度为511 bp的表达序列标签（EST）序列,对所测EST序列进行拼接,得到75条一致性序列,包括15条重叠群（Contigs）和60条单一序列（Singleton）。对测序结果进行比对分析,获得了15条已报道有一定功能的一致性序列,其中4条与免疫相关;另外60条一致性序列还未见报道。研究表明,中华绒螯蟹血细胞cDNA文库已构建成功,且质量较高,从而为开展中华绒螯蟹功能基因克隆、分析和功能基因组学研究奠定了基础。     

中华绒螯蟹血细胞cDNA文库的构建及质量初检

为了筛选中华绒螯蟹Eriocheir sinensis血细胞免疫的相关基因,促进蟹类免疫防治的进展,采用Gubler-Hoffman法构建了中华绒螯蟹血细胞的cDNA文库。结果表明:该文库初始滴度为4.50×106cfu/mL,库容为3.3×106cfu/mL,重组率为73%,插入片段大小多为800² 500 bp。随机挑取了94个重组子进行测序初检,共得到93条平均长度为511 bp的表达序列标签(EST)序列,对所测EST序列进行拼接,得到75条一致性序列,包括15条重叠群(Contigs)和60条单一序列(Singleton)。对测序结果进行比对分析,获得了15条已报道有一定功能的一致性序列,其中4条与免疫相关;另外60条一致性序列还未见报道。研究表明,中华绒螯蟹血细胞cDNA文库已构建成功,且质量较高,从而为开展中华绒螯蟹功能基因克隆、分析和功能基因组学研究奠定了基础。     

中华绒螯蟹幼蟹对饲料中维生素A的适宜需要量

在室内条件下研究了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹对维生素A的适宜需要量.在基础饲料中分别添加0、5 000、10 000、20 000、40 000、80 000、160 000和320 000 IU/kg的维生素A,得到8种等氮等能的半精制饲料,投喂体重为(1.54±0.45) g的幼蟹10周.结果表明,随着饲料中维生素A添加量的提高,幼蟹的增重率和特定生长率先升高后降低,当维生素A添加量为80 000 IU/kg时,幼蟹的增重率和特定生长率最高,分别为82.23%和0.86%;饲料效率随着饲料中维生素A添加量的升高先升高后降低,当添加量为40 000 IU/kg时饲料效率最高;饲料中维生素A添加量为320 000 IU/kg时,蟹体粗脂肪的含量达到最高,并显著高于其他各试验组(P<0.05);肝胰腺超氧化物歧化酶活性随着饲料中维生素A添加量的升高先在一定水平波动,而后明显下降并在较低水平波动;投喂不同维生素A添加量饲料对中华绒螯蟹眼中维生素A的含量没有显著的影响.结果提示,饲料中添加适量的维生素A,可以促进中华绒螯蟹的生长,降低饲料系数,并且可以在一定程度上提高非特异性免疫能力.采用Broken-line模型分析得出中华绒螯蟹幼蟹对维生素A的适宜需要量为69 740～70 770 IU/kg.     

不同水域中华绒螯蟹雄体营养成分及风味成分差异性研究

为评价不同水域中华绒螯蟹Eriocheir sinensis雄体的营养品质及其风味物质含量的差异性,采用生化分析方法,对长江固城湖、阳澄湖水域、辽河(入海口)和黄河(中上游)等水域中华绒螯蟹雄体蟹膏和肌肉中的基本营养成分,以及矿物质元素、脂肪酸、氨基酸、核苷酸和胆固醇等营养物质的含量进行检测和对比分析。结果表明:长江固城湖、阳澄湖、辽河(入海口)和黄河(中上游)等水域的中华绒螯蟹雄蟹在矿物质、氨基酸和胆固醇等营养成分组成上有显著性差异(P<0.05);辽河水域雄蟹蟹膏中铁元素含量最高,为284.3 mg/kg,显著高于其他3个水域(P<0.05);长江固城湖水域雄蟹可食部中锌元素含量最高,为63.5 mg/kg,显著高于黄河水域和阳澄湖水域(P<0.05);固城湖水域雄蟹可食部中多不饱和脂肪酸(PUFA)含量最高且显著高于其他3个水域(P<0.05);固城湖和阳澄湖水域雄蟹中氨基酸含量(呈味氨基酸、必需氨基酸及总氨基酸)显著高于黄河、辽河水域(P<0.05);辽河水域雄蟹蟹膏中肌苷酸(IMP)含量最高(P<0.05)。研究表明,不同水域中华绒螯蟹雄体可食部位营养成分组成具有一定差异,本研究结果可为中华绒螯蟹建立质量标准和品质鉴定指标提供数据支持。     

不同水域中华绒螯蟹雄体营养成分及风味成分差异性研究

为评价不同水域中华绒螯蟹Eriocheir sinensis雄体的营养品质及其风味物质含量的差异性,采用生化分析方法,对长江固城湖、阳澄湖水域、辽河(入海口)和黄河(中上游)等水域中华绒螯蟹雄体蟹膏和肌肉中的基本营养成分,以及矿物质元素、脂肪酸、氨基酸、核苷酸和胆固醇等营养物质的含量进行检测和对比分析。结果表明:长江固城湖、阳澄湖、辽河(入海口)和黄河(中上游)等水域的中华绒螯蟹雄蟹在矿物质、氨基酸和胆固醇等营养成分组成上有显著性差异(P<0.05);辽河水域雄蟹蟹膏中铁元素含量最高,为284.3 mg/kg,显著高于其他3个水域(P<0.05);长江固城湖水域雄蟹可食部中锌元素含量最高,为63.5 mg/kg,显著高于黄河水域和阳澄湖水域(P<0.05);固城湖水域雄蟹可食部中多不饱和脂肪酸(PUFA)含量最高且显著高于其他3个水域(P<0.05);固城湖和阳澄湖水域雄蟹中氨基酸含量(呈味氨基酸、必需氨基酸及总氨基酸)显著高于黄河、辽河水域(P<0.05);辽河水域雄蟹蟹膏中肌苷酸(IMP)含量最高(P<0.05)。研究表明,不同水域中华绒螯蟹雄体可食部位营养成分组成具有一定差异,本研究结果可为中华绒螯蟹建立质量标准和品质鉴定指标提供数据支持。     

红壳色中华绒螯蟹仔蟹养殖方式研究

为探讨养殖方式对红壳色不同家系中华绒螯蟹Eriocheir sinensis仔蟹生长的影响,采用室内群体养殖、室内单体养殖和室外稻田养殖3种方式,比较了红壳色(A)、红壳家系中正常壳色(B)、光合1号(C),以及拟建立的早熟(D)、近亲早熟(E)育种家系仔蟹的生长特征。结果表明:室内群体养殖方式下,红壳色A组仔蟹的存活率为35.8%,仅与D组有显著性差异(P<0.05);A组仔蟹头胸甲宽的变异系数(CV)为27%,个体大小差异较小,与其余组间有显著性差异(P<0.05);A组仔蟹体质量特定生长率(SGR)为7.0%/d,各组间无显著性差异(P>0.05)。室内单体养殖方式下,红壳色A组仔蟹的存活率为86.7%,显著高于B、E组(P<0.05);A组仔蟹头胸甲宽的CV为52%,个体大小差异较大,与C、D组有极显著性差异(P<0.01);A组仔蟹体质量SGR为5.7%/d,A组与B、C、E组仔蟹生长差异明显(P<0.05)。室外稻田围隔养殖方式下,红壳色A组仔蟹的存活率为3.2%,极显著低于B、C、D组(P<0.01);A组仔蟹头胸甲宽的CV为12%,极显著低于E、D组(P<0.01);A组仔蟹体质量SGR最低,为8.1%/d,各组间无显著性差异(P>0.05)。研究表明,室内单体养殖红壳色仔蟹能显著提高其成活率,有助于获得更多育种家系相关性状的信息。     

早熟和正常中华绒螯蟹大颚器官发育及超微结构

对早熟和正常发育的中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)大颚器官(mandibularorgan,MO)进行解剖学和组织学研究,发现早熟蟹的MO在当年秋季已充分发育,MO细胞直径在当年11月达到最大值;而正常发育幼蟹的MO在当年细胞排列紧密,直到翌年秋季才充分发育。正常发育成蟹(二秋龄蟹)的MO细胞直径在10月达到最大值,明显大于早熟蟹(P<0.05)。表明早熟蟹MO较正常发育蟹提早一年发育,但是,秋季早熟蟹MO的发育速度和发育良好程度均不及二秋龄蟹MO的发育,这可能是早熟蟹卵黄发生过程较缓慢,较二秋龄蟹滞后约一个月达到次级卵黄发生末期的原因。中华绒螯蟹MO细胞超微结构的显著特征是丰富而形态多样的光面内质网和具小管状内嵴的线粒体,以及丰富的游离核糖体。     

早熟和正常中华绒螯蟹大颚器官发育及超微结构

对早熟和正常发育的中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)大颚器官(mandibularorgan,MO)进行解剖学和组织学研究,发现早熟蟹的MO在当年秋季已充分发育,MO细胞直径在当年11月达到最大值;而正常发育幼蟹的MO在当年细胞排列紧密,直到翌年秋季才充分发育。正常发育成蟹(二秋龄蟹)的MO细胞直径在10月达到最大值,明显大于早熟蟹(P<0.05)。表明早熟蟹MO较正常发育蟹提早一年发育,但是,秋季早熟蟹MO的发育速度和发育良好程度均不及二秋龄蟹MO的发育,这可能是早熟蟹卵黄发生过程较缓慢,较二秋龄蟹滞后约一个月达到次级卵黄发生末期的原因。中华绒螯蟹MO细胞超微结构的显著特征是丰富而形态多样的光面内质网和具小管状内嵴的线粒体,以及丰富的游离核糖体。