侵染百合的李属坏死环斑病毒病（PNRSV）的研究

 【目的】在分子水平上鉴定百合上发生的李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）【方法】对待测百合种球随机抽样，在温室内种植并观察，长出叶片后，用RNA Extraction Kit (Sangon, China)从幼嫩的叶组织中提取核酸，将反转录出的cDNA用 PNRSV的特异性引物进行PCR扩增，电泳PCR产物得到了450bp的目的片段。低熔点胶回收并克隆至pGEM-T-easy载体测序后进行序列比对分析。【结果】 从百合中所扩增的450bpcDNA的核苷酸序列与27个早期已报道的PNRSV分离物的CP 基因的同源性为84.5%～99.1%。【结论】百合是PNRSV的一新寄主。     

李属坏死环斑病毒怀柔分离物(PNRSV-HR)外壳蛋白基因片断的克隆与序列分析

应用RT-PCR方法检测了采自北京市怀柔区的樱桃叶片,将此PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上,通过转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,克隆了含有目的片段的重组质粒,并进行序列测定和分析。序列分析结果表明,认为该分离物外壳蛋白基因片断与李属坏死环斑病毒的NRSiz8株系的同源性最高,为98%,与德国分离物Ring17的同源性达99%;通过进化关系分析,认为该分离物属于引起温和症状的group,认为该分离物的第5,62,81和126位氨基酸也与CH9血清型引起温和症状的保守的替换相同。     

浙江海宁月季上发现李属坏死环斑病毒

采用双夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),对杭州、嘉兴、绍兴3市6县(市、区)的果树园林植物进行李属坏死环斑病毒病的病情调查,采集检测样品包括樱桃、桃、李、杏和月季等12种寄主植物共计102个.结果表明,10个海宁月季样品的ELISA结果呈阳性,其他样品呈阴性;阳性样品经RT-PCR检测和CP基因测序验证,确认海宁月季感染了李属坏死环斑病毒.     

樱桃李属坏死环斑病毒病发生调查监测研究

通过田间调查监测,在经过多年实践研究的基础上,提出了李属坏死环斑病毒病田间调查监测方法,研究总结出该病的发生动态、其发生程度与地势、管理、品种、树龄等的关系,可供李属坏死环斑病毒病科学控制研究等参考。     

李属坏死环斑病毒扬州分离物CP基因的原核表达及抗血清制备

李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)严重危害蔷薇科植物,在世界范围内普遍分布。为建立快速有效的PNRSV检测方法,依据PNRSV CP基因序列设计引物,并从桃叶片上扩增PNRSV-CP片段,将双酶切产物插入原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-CP^PNRSV,转化大肠埃希菌Rosetta菌株,IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE电泳检测显示,在分子量约25 ku处有蛋白质条带,符合预期大小。镍柱亲和纯化PNRSV CP蛋白,以其纯化蛋白质免疫健康新西兰白兔,制备多克隆抗血清。Western blot、ELISA、Dot blot检测结果显示,制备的抗血清能检测到PNRSV CP基因在感病植物叶片中表达,而在健康植株中未检测到;制备的抗血清滴度稀释至1∶64 000时,仍能与纯化蛋白质发生特异性反应。综上,制备的PNRSV抗血清特异性强、效价高,可用于PNRSV的快速检测。     

樱桃李属坏死环斑病毒病病情分级方法研究

通过实验室鉴定、田间定点调查监测,在经过多年实践研究的基础上,根据樱桃李属坏死环斑病毒病的症状表现和发生规律等,提出了以叶片穿孔程度作为分级标准的病情评价指标,可供李属坏死环斑病毒病发生规律研究及其防治效果评价等参考。     

一步法 RT-LAMP-HNB 检测兰花建兰花叶病毒和齿舌兰环斑病毒方法的建立

【目的】全世界兰花病毒有 50 余种,建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CymMV）和齿舌兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒病,因此建立针对病毒的高效监测、检测方法,对控制兰花病毒感染具有至关重要的意义。【方法】以兰花病毒 CymMV 和 ORSV 为试验材料,采用反转录 - 环介导等温扩增方法（RT-LAMP）进行病毒 RNA 的扩增,从而建立 CymMV 和 ORSV 的快速检测方法。分别根据两种病毒的 cp 基因序列保守区设计 RT-LAMP 引物,在一步法 RT-LAMP 反应体系中加入羟基萘酚蓝（HNB,终浓度 200 µmol/L）作为扩增产物指示剂,不需开盖进行凝胶电泳检测,便可直接根据体系颜色变化判读反应结果。【结果】利用该检测方法能够在 2 h 测出样品中是否存在CymMV 和 ORSV 病毒 RNA,其灵敏度是 RT-PCR 的 10 倍。对 20 株田间样品进行一步法 RT-LAMP-HNB 检测,根据田间检测结果显示,CymMV 检出率为 70%,ORSV 检出率为 55%,与 RT-PCR 结果保持一致,该法适用于田间样品检测。【结论】建立的一步法 RT-LAMP-HNB 是一种灵敏、快速、特异、便捷的 CymMV 和 ORSV 检测方法,仅需要简单控温设备如水浴锅便可进行核酸扩增,适用于在基层或不便利地区推广使用。     

樱桃李属坏死环斑病毒病综合控制技术研究初报

通过药剂试验,筛选出防治樱桃李属坏死环斑病毒病较好的药剂和药剂使用方法,20%盐酸吗啉双{胍*胶}铜可湿性粉剂、3.85%三氯唑核苷*铜*锌水乳剂、含氨基酸叶面肥巨创、18%丙多*吗啉胍可湿性粉剂对樱桃李属坏死环斑病毒病有一定的防治作用,喷雾处理20%盐酸吗啉双胍*胶铜可湿性粉剂、3.85%三氯唑核苷*铜*锌水乳剂、含氨基酸叶面肥巨创、18%丙多*吗啉胍可湿性粉剂平均防效分别是56.42%、{54.15%}、52.11%、52.62%.1 a内随着防治次数的增加,防治效果也随着增加,结合该病发生规律,提出樱桃李属坏死环斑病毒病综合控制措施.     

西安地区樱桃李属坏死环斑病毒病鉴定和田间发生规律

通过实验室鉴定、田间定点监测和大田调查,发现樱桃李属坏死环斑病毒病可通过嫁接、汁液摩擦等途径传播,病毒形态为球形,大小30 nm,无包膜;在西安地区年发生消长历经始发期、快速增长期、稳定期、衰退期4个阶段,一年具有两个发病高峰,相邻年份病害发生差异不大,但有一个缓慢增长的过程.川道、密度大、管理粗放有利于樱桃李属坏死环斑病毒病的发生,目前种植的大樱桃品种发病较重,当地小樱桃品种发病较轻.     

口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立

旨在建立口蹄疫病毒可视化逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法。以猪口蹄疫灭活疫苗为材料,设计两对RT-LAMP引物,建立FMDV可视化RT-LAMP检测方法,并与普通PCR检测方法进行比较,同时进行特异性试验和敏感性试验。对从油佐剂疫苗中提取FMDV核酸方法进行比较结果发现,用商品化试剂盒提取时,3种样品处理方法对病毒RNA提取量没有显著影响;Trizol法提取RNA时,从油佐剂疫苗中直接提取,获得的RNA量最大,与其他2种方法差异极显著(P0.01)。建立了口蹄疫病毒可视化RT-LAMP方法,该方法检测到模板RNA最低稀释度为10-9,比RT-PCR方法灵敏10倍,特异性好。     

牛病毒性腹泻病毒一步 RT-LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立一种快速、敏感、特异的检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法,为诊断与监测BVDV 提供准确可靠工具。[方法]根据GenBank公布的BVDV序列,在其保守序列区域设计了一套 LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测 BVDV的 RT-LAMP方法。[结果]该方法能在56℃等温条件下40分钟完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。该方法具有良好的特异性和敏感性,最低能检测到3.74×100 copies/μl的病毒 RNA,而且与其他病毒无交叉反应。[结论]该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。     

反转录-环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测马铃薯病毒

为寻求低成本快速准确灵敏度高的马铃薯病毒检测方法,根据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的外壳蛋白基因序列设计4条特异引物,建立LAMP检测技术。结果表明:LAMP检测方法灵敏度下限是10个拷贝的病毒量,该方法检测PVX、PVY和PLRV特异性好,灵敏度高,1h可完成检测,且检测成本低。     

番茄黑环病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了快速有效地检测出植物样品中的番茄黑环病毒(tomato black ring virus,TBRV),根据TBRV的保守序列设计RT-LAMP反应的特异引物,通过试验成功建立了TBRV的RT-LAMP特异性检测方法。该方法检测快速,约27 min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同样侵染马铃薯的马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯Y病毒(PVY)、番茄斑萎病毒(TSWV)及番茄环斑病毒(ToRSV);灵敏度高,比普通RT-PCR灵敏度至少高10倍;并可通过肉眼观察反应颜色的变化直接进行结果判断。该方法适用于TBRV的快速检测。     

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒实时荧光LAMP检测方法的建立及应用

笔者研究构建了一种基于ESE-Quant tube scanner设备的新型实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)IHHNV检测方法,评价其敏感性、特异性、反应速度和实际检测结果。结果表明,IHHNV实时LAMP检测方法在63℃条件下,30 min内检测到106稀释的基因组DNA,可检测到24个质粒拷贝;与27种包括多种水生动物以及对虾常见病原DNA均无交叉反应。通过对152份实际样品的检测,实时荧光LAMP检测方法的检出阳性率为59.87%,与real-time PCR方法相当,高于其他检测方法。本研究建立的IHHNV实时LAMP检测方法对现场诊断具有较大的应用潜力。     

海产品中霍乱弧菌实时浊度LAMP 检测方法的建立

为建立一种快速、敏感、特异、有效的检测霍乱弧菌方法,以有效预防及控制霍乱弧菌感染,针对霍乱弧菌 ctxA 基因的保守区域设计引物,应用实时浊度仪进行环介导等温扩增（LAMP）,研究其特异性与灵敏性,并利用该体系检测海产品中的霍乱弧菌。结果显示,含 ctxA 基因的霍乱弧菌可得到特异性扩增,而其他与霍乱弧菌（含 ctxA 基因）共存于海产品中的7种细菌均未得到扩增,DNA 检测下限为81 fg/μL。用建立的实时浊度 LAMP 检测方法对150份海产品进行检测,检出含霍乱弧菌的海产品2份,与荧光定量 PCR 结果一致。表明建立的 LAMP 检测方法可用于海产品中霍乱弧菌的检测。     

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为更加快速、灵敏地检测草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV),建立环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据GenBank中GCRV HZ08等毒株VP6蛋白基因序列设计引物,以GCRV弱毒疫苗株(GCHV-892)总RNA为模板建立RT-LAMP反应,对扩增产物用限制性内切酶PvuⅡ进行酶切鉴定,所得酶切产物大小符合预期值。随后对LAMP反应体系包括Mg2+、dNTPs、甜菜碱(betaine)和内外引物浓度比进行了优化,并以含VP6蛋白基因的重组质粒(pEASY-VP6)为模板考量了该方法的敏感性,结果显示最低检测限为10copies.μL-1,比RT-PCR检测方法敏感10倍。特异性试验表明与白斑综合征病毒(WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)无交叉反应。应用RT-LAMP方法检测16份疑似出血病草鱼,6份病料获得了阳性扩增,与RT-PCR检测结果一致。