鸡胚盘内转染外源基因的研究

采用显微注射法，分别将人生长激素(hGH)基因和人组织激肽释放酶基因(KLK1)直接注射到孵化24h的鸡胚中，继续孵化。在注射的320枚鸡胚中，孵化前7d死亡194枚，8～18d死亡108枚，孵出雏鸡18只，孵出率为5.6％(18/320)。8只雏鸡分别于出壳后的第1、2、3、5天死亡。7只于3月龄死亡。3只鸡(1公2母)存活至今，并开始产蛋。死亡雏鸡具有脚瘫、体弱、斜颈、站立不稳等异常表现，存活鸡无外观异常，但有产蛋紊乱现象。从孵化4d后死亡的150放鸡胚和18只出壳雏鸡的组织提取基因组DNA，并用DNA杂交试验进行基因整合检测，结果发现其中的3枚鸡胚和3只雏鸡为人生长激素基因整合阳性，基因整合率为12.5％(6/48)；18枚鸡胚和6枚雏鸡为KLK1整合阳性，整合率为22.2％(24/108)。结果表明：鸡胚盘内细胞通过显微注射法可以转染外源基因。     

胚盘下腔显微注射慢病毒载体制备转基因鹌鹑

利用显微注射法给每枚新鲜鹌鹑种蛋胚盘下腔注射滴度为1×109 TU/mL人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)慢病毒载体1μL,直接封口后孵化出雏,应用倒置荧光显微镜及分子生物学方法检测。结果显示:在注射慢病毒后第4天,倒置荧光显微镜下观察到发育胚胎卵黄膜上绿色荧光蛋白较强表达;试验操作240枚鹌鹑种蛋,孵化出雏34只,孵化率为14.1%;对新出雏鹌鹑解剖后,可检测到喙部、眼部、羽毛、肝脏、肾脏、盲肠、肺脏、小肠、大肠、输卵管、心脏、胸肌及大脑等内脏器官中绿色荧光蛋白广泛性表达,但在性腺中绿色荧光蛋白表达信号较弱;对发育到性成熟期的G0代19只雄性鹌鹑精液基因组聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测,其中3只为阳性,阳性率为15.7%(3/19);在3只阳性雄性鹌鹑的236只后代中,有4只经PCR及印迹杂交(Southern-blot)检测为阳性,阳性率为1.69%(4/236)。结果表明:利用慢病毒载体胚盘下腔注射成功生产出转基因鹌鹑,为转基因禽类制备提供了一种简便易行的好方法。     

猪分离卵泡石蜡切片制作的改进

猪完整分离有腔卵泡内的卵泡液含量丰富,采用常规石蜡切片制作方法往往很难制作出结构自然完整的卵泡切片。本试验用Bouin氏固定液固定猪分离卵泡72 h,脱水程序采取二甲苯∶乙醇(1∶1)过渡的方法,并适当加长透蜡时间。通过改进卵泡固定、脱水和透明等程序后,成功制成效果优良的猪分离卵泡组织切片。     

草地早熟禾的石蜡切片制作技术的优化

以草地早熟禾为材料,在传统石蜡切片方法的基础上,结合草地早熟禾组织结构特点,对脱水、透明、染色等重要制片环节进行改良。结果显示:脱水过程中,将乙醇逐级梯度脱水时间增加,有利于后续浸蜡,避免石蜡切片上的植物材料脱落;透明过程中,将纯二甲苯增加更换频率,同时减少每次处理时间,其透明更彻底;有效的番红固绿染色时间组合处理,使草地早熟禾解剖形态更为清晰。一系列针对草地早熟禾石蜡切片的优化,使得解剖图像染色均匀、图像清晰,不易出现植物材料脱落及组织结构不完整的情况,是观察草地早熟禾形态结构的有效方法。     

脊髓等柔软组织石蜡组织切片制作技术探讨

以家兔脊髓组织为实验材料,探讨制作大批量脊髓组织教学标本简便、可行的方法。结果表明,用常规方法制作优质的脊髓组织切片时,在10%的中性福尔马林固定液中固定7 d,进行H.E染色时,苏木精染色的时间为30 min,伊红染色时间6 min,制作的切片细胞核嗜碱性、呈蓝紫色,细胞质和细胞间质嗜酸性、呈粉红色,胞质内尼氏体为蓝紫色颗粒,两者间颜色对比度好,容易区分,是制作大批量教学标本的可选方法。     

转基因鸡制备方法的研究进展

在获得转基因哺乳动物的基础上,由于禽类(鸡)作为生物反应器本身所具有的优势,许多研究者投向制备转基因鸡的研究上。本文简要叙述了常用的制备转基因鸡的方法。其中,结合本实验室的情况,重点介绍了胚盘直接注射法。     

制作石蜡切片的注意事项

石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法.石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构,也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法,而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中.     

制作石蜡切片的注意事项

石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。     

一种快捷安全的动物病理组织石蜡切片制作技术

为探索一种快捷、安全、实用的病理切片制作技术,本试验在传统石蜡切片制作技术的基础上,通过技术改良与创新,发现了一种快捷安全的病理切片制作方法。试验结果表明,运用这种方法制作病理切片不仅简单快捷,而且制得的病理切片质量高,H.E.染色细胞着色良好,镜下观察细胞结构清晰,胞质与胞核对比鲜明;本方法兼具冰冻切片和石蜡切片二者的优点。     

石蜡切片TUNEL法检测肉仔鸡法氏囊细胞凋亡的条件优化

从蛋白酶K的浓度、DAB显色时间、苏木素复染时间等对采用石蜡切片TUNEL法检测10日龄健康ROSS308肉仔鸡法氏囊组织内细胞凋亡的条件进行了优化。结果表明,TUNEL法最佳条件蛋白酶K浓度为20μg/mL,DAB显色时间为8 min,苏木素复染时间为10 s。优化后的石蜡切片TUNEL法,即60℃烤片5 h,20μg/mL蛋白酶K 37℃消化30 min,DAB显色8 min,苏木素复染10 s时,能特异地显示凋亡细胞为棕黄色,其他细胞核为蓝色,且对比明显,背景浅,组织结构完整清晰。     

中央杏仁核内微量注射地塞米松对NA／NPY在NTS所致心血管效应的影响

运用电生理学技术和心血管实验,观察了中央杏仁核(CeA)神经元与孤束核(NTS)神经元活动之间的相互作用,以及在CeA 内注射地塞米松(Dex)对NTS内去甲肾上腺素(NA)/神经肽Y(NPY)诱导的心血管效应的影响。电生理学实验显示,用L-谷氨酸兴奋CeA 神经元后,NTS内神经元活动主要呈现抑制反应(12/18);向NTS内注射NPY 后,CeA 内神经元活动也以抑制反应为主(13/23)。向CeA 内注射Dex,可以消除NTS内微量注射NA/NPY 所引起的降压和减慢心率效应。NA:动脉血压下降(- 0.37±0.25) kPa,心率下降(- 5±5) 次/m in,对照分别为(- 2.57±0.21) kPa,(- 33±11) 次/m in。NPY:(- 0.47±0.29)kPa,(- 10±8) 次/m in,对照(- 3.37±0.36) kPa, (- 50±9) 次/m in。由此表明,不仅CeA 与NTS在心血管活动调节中存在相互抑制作用,而且当CeA 受到高水平的糖皮质激素作用时,会抑制NTS内降压系统的作用。这可能是应激致发高血压的重要原因     

Exogenous DNA Uptake of Boar Spermatozoa by a Magnetic Nanoparticle Vector System

The sperm‐mediated gene transfer method is applicable to transgenesis in many species that use spermatozoa for reproduction recently, which has been shown various results. In the current study, we show that transgenic porcine embryos can be efficiently produced by employing a simple transfection method that uses magnetic nanoparticles (MNPs). The complexes formed between plasmid DNA and MNPs were bounded on ejaculated boar spermatozoa at a higher efficiency compared to methods using DNA alone or lipofection. Using confocal microscopy, rhodamine fluorophore‐labelled MNPs were detected on external surfaces of the spermatozoa membrane, which were bounded on zona pellucida of in vitro maturated oocyte during in vitro fertilization. Electron microscopy revealed that clusters of MNPs were detected in inside of plasma membrane and nucleus of the spermatozoa head. Additionally, we found that magnetofected boar spermatozoa could be fertilized with oocytes in vitro and that the resulting gene of green fluorescent protein was detected in fertilized eggs by genomic PCR analysis. Taken together, these results suggest that MNPs can be used to efficiently introduce a transgene into embryo via spermatozoa.     

生长猪对转基因豆粕外源DNA的代谢研究

研究了抗草甘膦转基因豆粕中的外源DNA在生长猪体内的代谢和沉积。选用去势公猪，于回肠末端安装简单T型瘘管，饲喂常规和转基因豆粕日粮，收集回肠食糜和粪便；另外进行生长猪饲喂试验42d，添加约30％常规或转基因豆粕，屠宰后采取组织样品，检测外源DNA残留。结果表明，在回肠食糜和粪便中检出源自抗草甘膦豆粕的外源cp4 epsps基因，但重现率均仅有6．7％，外源DNA的完整性在小肠后段很大程度上受到破坏；PCR检测下限为5Pg时，在生长猪肝脏、肌肉、脾脏和胸腺组织中无cp4 epsps基因残留，外源DNA已被代谢降解。     

外源病毒检验用抗鸡传染性法氏囊病病毒特异性血清的制备与检定

为制备外源病毒检验用抗鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)的特异性血清,对300只3~4周龄的SPF鸡进行了基础免疫和加强免疫。最后一次免疫后21d采血并分离血清,血清经混合、分装、冷冻真空干燥后,对其进行了无菌检验、外源病毒检验、剩余水分测定、中和效价测定和特异性检验。结果表明,本研究制备的抗IBDV特异性血清无菌检验、外源病毒检验和剩余水分测定均符合《中华人民共和国兽药典》三部(二〇一〇年版)规定;血清中和效价为1:5747,与IBDV B87株毒种中和指数为104.3,与鸡新城疫病毒La Sota株、鸡传染性支气管炎病毒H120株、鸡传染性支气管炎病毒H52株、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡痘病毒、禽呼肠孤病毒S1133株的中和指数均不大于10,通过AGP、ELISA、HI等试验确定血清中不含其他禽源外源病毒抗体。本研究为鸡传染性法氏囊病活疫苗或毒种的外源病毒检验提供了具有良好特异性和高效价的中和用血清。     

外源病毒检验用抗鸡传染性支气管炎病毒特异性血清的制备与检定

为制备外源病毒检验用抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)特异性血清,对300只3~4周龄的SPF鸡进行基础免疫和加强免疫;最后一次免疫21 d后,采血并分离血清;对血清经混合、分装、冷冻、真空干燥后,进行无菌检验、外源病毒检验、剩余水分测定、中和效价测定和特异性检验。结果表明:本研究制备的抗IBV特异性血清的无菌检验、外源病毒检验和剩余水分测定结果均符合现行《中华人民共和国兽药典》规定;血清中和效价为1:800,与IBV H120种毒株的中和指数为106.3,与鸡传染性法氏囊病毒B87株、鸡新城疫病毒La Sota株、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡痘病毒、禽呼肠孤病毒S1133株的中和指数均不大于10;通过AGP、ELISA、HI等试验,确定该血清中不含其他禽源外源病毒抗体。本研究为鸡传染性支气管炎活疫苗或毒种的外源病毒检验提供了具有良好特异性和高效价的中和用血清。     

微卫星DNA在牦牛亲权鉴定中的应用研究

为了探讨微卫星DNA在牦牛亲权鉴定应用的可行性,选用FAO推荐的17个微卫星座位,检测其在天祝白牦牛群体中的多态性水平,计算这17个微卫星座位用于亲权鉴定的累积排除率。结果表明,17个微卫星座位平均等位基因数为6.235;多态信息含量介于0.191~0.824之间,平均为0.608,为高度多态;一个候选亲本的累积排除概率为0.997,2个候选亲本的累积排除概率为0.999 999 97,各个微卫星座位零等位基因频率均在0.05以下,微卫星DNA可以应用于牦牛的亲权鉴定。