新疆家蚕抗菌肽(Cecropin-XJ)特性的研究

探讨了新疆家蚕抗菌肽 (Cecropin -XJ)的抗菌特性。根据琼脂糖孔穴扩散法 ,检测抗菌肽的热稳定性、抑菌效价、对氨苄青霉素抗性菌的抑菌作用 ,检测抗菌肽对酸碱盐、人造胃液的耐受性及其抗菌谱。结果表明新疆家蚕抗菌肽 (Cecropin -XJ)具有很强的热稳定性、能够杀灭氨苄青霉素抗性菌、对酸碱盐、人造胃酸有一定的耐受性 ,其杀菌活力为 :1μg/ μl抗菌肽与 2 4 0 0 0单位的氨苄青霉素杀菌活力相当。新疆家蚕抗菌肽能够杀灭革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 ,而对革兰氏阳性菌的抗菌活力高于革兰氏阴性菌 ,这一发现将为抗菌肽在农业、医疗卫生、畜牧业等方面的应用奠定基础 ,同时为深入研究抗菌肽作用机制提供了依据     

毕赤酵母工程菌原果胶酶的分离纯化

采用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤和离子交换层析等方法,对毕赤酵母工程菌发酵液中的原果胶酶进行了分离纯化,测定了其分子质量,并确定了离子交换层析法的最佳离子交换条件。结果表明,硫酸铵的饱和度为70%时,可以使原果胶酶的回收率达到71.9%,比活力为1 096.35 U/m g;经Sephadex G 75凝胶过滤,原果胶酶回收率达到57.6%,酶的比活力提高到3 762.40 U/m g;最佳离子交换条件为:0~0.5 m o l/L N aC l(缓冲体系为N oA c-HA c,pH 5.8)溶液线性洗脱、Sepharose F ast F low离子交换层析分离,在该条件下酶的比活力提高到9 743.20 U/m g,纯度为粗酶液的18.91倍,达到了电泳级;SDS-PAGE电泳结果表明,其分子质量为43.17 ku。     

重组抗菌肽Cecropin P1在毕赤酵母X-33中的表达以及纯化后的生物活性分析

为了在毕赤酵母 Pichia pastoris 表达系统中表达猪源Cecropin P1并分析其生物活性,根据Cecropin P1的氨基酸序列和毕赤酵母的密码子偏嗜性设计引物,通过SOEing法合成全基因片段载入到PpicZαA质粒中,酶切线性化重组质粒PpicZαA-cecropin P1后电穿孔导入毕赤酵母X-33中进行整合,经Zection筛选和PCR检测获得高拷贝的转化子.发酵表达后将表达产物经加热预处理和Sephadex G-25层析及冻干浓缩后,Tricine-SDS-PAGE显示明亮单一条带.采用琼脂扩散法对纯化后的抗菌肽的热稳定性、酸碱稳定性、耐胰酶和胃蛋白酶稳定性进行了生物活性分析,结果表明Cecropin P1具有较强的热稳定性、酸稳定性及胃蛋白酶稳定性,但是在碱性环境下和胰酶作用下抑菌活性明显下降.     

柱层析法分离纯化菊粉酶的研究

以黑曲霉固体发酵法产生的粗菊粉酶为试材,采用葡聚糖凝胶层析法和DEAE纤维素52柱层析法对经过硫酸铵沉淀后的粗酶进行了分离纯化,得到接近电泳纯的高纯度菊粉酶.结果表明:以菊粉为底物研究酶活时,DEAE-纤维素52离子交换层析得到较好的分离效果,主要活力峰比活力12.64U·mg-1提纯了6.37倍;以蔗糖为底物时,SephadexG100分离效果好,比活力35.57U·mg-1提纯了3.78倍.     

家蚕感染球孢白僵菌后4种抗菌肽基因的表达分析

【目的】阐明家蚕(Bombyxmori)抗菌肽对球孢白僵菌感染的应答模式,为揭示家蚕及鳞翅目昆虫抗真菌机制提供参考依据。【方法】利用实时荧光定量PCR检测家蚕被球孢白僵菌感染后抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme的表达情况,比较4种抗菌肽在家蚕脂肪体、血淋巴、马氏管和中肠中不同时间点的表达差异。【结果】经球孢白僵菌诱导后,cecropinA基因在家蚕脂肪体中的最高上调表达倍数为10.2倍,在血淋巴中的最高上调表达倍数为13.2倍,在马氏管中感染初期显著上调表达(P<0.05,下同),在中肠中感染后期显著上调表达;gloverin2基因在家蚕脂肪体中出现2次上调表达过程,最高上调表达倍数为15.7倍,在血淋巴中感染前期呈上调表达,在马氏管中略呈下调表达,中肠中的gloverin2基因在接种后16~48 h呈显著上调表达,最高上调表达倍数为6.7倍;lebocin1/2基因在家蚕脂肪体和血淋巴中的最高上调表达倍数分别为19.4和22.4倍,在马氏管中仅在接种后16 h呈显著上调表达,在中肠中则是接种后24~48 h呈显著上调表达;lysozyme基因在家蚕脂肪体中显著上调表达,在血淋巴和马氏管中感染初期也呈显著上调表达,但在中肠中的表达无明显规律。【结论】cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因在球孢白僵菌侵染家蚕的过程中均不同程度地被诱导上调表达,尤其在家蚕脂肪体和血淋巴中较明显,由此推测这4种抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染过程中发挥重要作用。     

鸡白细胞中抗菌肽的分离纯化及活性鉴定方法的建立

【目的】建立鸡白细胞中抗菌肽的分离纯化及活性鉴定方法。【方法】通过腹腔注射酪蛋白生理盐水,从鸡人工腹水中得到白细胞;将收集的白细胞,通过超声波反复破碎、体积分数10%乙酸浸提、低温高速离心、旋转蒸发除去乙酸和冷冻干燥等方法,得到抗菌肽粗提物;将得到的粗提物,经CM-Sepharose Fast Flow弱酸性阳离子交换层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,收集分离的各组分,使用微量琼脂糖弥散法检测各组分的抗菌活性和最小抑菌浓度。【结果】共获得鸡抗菌肽粗提物0.270 g,经RP-HPLC分离纯化,抗菌肽离子交换阳性组分共分离出18个峰,其中6个峰对3种细菌均表现较强的抑菌活性,对鸡大肠杆菌E.coliO78(峰13)、金黄色葡萄球菌S.au-reus1056MRSA(峰15)和白色念珠菌C.albicansATCC10231(峰15)的最小抑菌浓度分别为0.627,0.001和0.035μg/mL。【结论】该法可以在实验室中用于鸡抗菌肽的提取及活性鉴定。     

离子交换层析纯化重组福安泰-03功能域的工艺条件研究

对阴离子交换树脂HiTrap DEAE Sepharose FF纯化重组福安泰-03功能域（rFAT-03）的合适条件进行了研究。通过试验,确定了柱层析的最佳操作条件,即在上样缓冲液为0.1mol/L Tris-HCl、洗脱缓冲液为1mol/L NaCl＋0.1mol/L Tris-HCl、pH为8.8的条件下,利用HiTrap DEAE SepharoseFF琼脂糖凝胶吸附柱,先用洗脱缓冲液从30%到60%洗脱3个柱床体积,再用洗脱缓冲液从60%到100%洗脱2个柱床体积。在此试验条件下,rFAT-03得率为35.97%,最终纯化的rFAT-03达电泳纯,纯度为99.5%。     

巴斯德毕赤酵母多拷贝整合表达组装禽流感病毒样颗粒

【目的】构建多拷贝整合表达禽流感病毒样颗粒的重组巴斯德毕赤酵母,为H5N1亚型禽流感基因工程疫苗提供基础。【方法】以巴斯德毕赤酵母GS115株18S rRNA基因(rDNA)部分序列,插入pPIC9K载体上XbaⅠ和Bsp1407Ⅰ位点间,构建多拷贝整合表达质粒p8K。再以禽流感病毒H5N1毒株基因组RNA为模板,RT-PCR扩增HA、M和NA基因,分别插入多拷贝载体p8K,构建表达质粒 p8K-HA/M/NA。表达质粒分别扩增后线性化,按比例混合,电转化GS115感受态细胞。增菌后,经遗传霉素G418抗性平板筛选、PCR鉴定携带HA、M和NA基因序列的多拷贝整合菌株。阳性菌株增菌、诱导表达、高压均质破碎后,Western-blot检测表达产物。【结果】PCR鉴定阳性的重组菌株,其细胞裂解蛋白,免疫印迹试验可检测到与HA、M₁和NA分子量一致的蛋白条带;电子显微镜可观察到大小约为80~120 nm 的病毒样颗粒,免疫鸡能产生抗禽流感病毒中和抗体。【结论】重组毕赤酵母能够多拷贝整合、表达、组装禽流感病毒样颗粒。     

卷须链霉菌木聚糖酶B的纯化

为了进一步研究链霉菌木聚糖酶的酶学性质，探讨了卷须链霉菌一种木聚糖酶的纯化方法。粗酶液经硫酸铵饱和度为20％～50％的分级沉淀和Q-sephrose FF离子交换柱层析2步纯化，得到一种电泳纯的木聚糖酶。定名为XynB；酶蛋白纯化倍数达到10．0倍，酶活力回收率达到24．0％。SDS-PAGE结果表明，该木聚糖酶的分子质量为22．0ku，属于低分子质量的木聚糖酶。     

离子交换树脂法纯化水溶性红曲红色素的研究

以弱碱性阴离子交换树脂D301吸附水溶性红曲色素溶液,95%乙醇洗脱,然后进行HPLC分析,结果表明,红曲色素含有8种黄色素组份,其最大吸收峰均在380 nm附近;弱碱性阴离子交换树脂D301可实现红色素与黄色素组份的有效分离.     

三种寡核苷酸纯化方法的比较

分别采用固相萃取法、电泳法、色谱法纯化寡核苷酸,色谱分析结果表明产物纯度高,固相萃取法纯化后的产物纯度低于电泳法与色谱法,但产量相对较大,PCR检测结果证明3种方法纯化的寡核苷酸具有良好的检测性能.在建立的固相萃取纯化试验条件下,对3种填料纯化寡核苷酸的效果、产量、成本进行了比较分析,结果表明,使用硅胶C绣和聚苯乙烯-二乙烯基苯填料(PS/DVB)填充的萃取小柱既能达到良好的纯化效果又可降低成本.     

人工蛹虫草固体培养基虫草素的分离纯化研究

以人工蛹虫草固体培养基为原料,首先热水浸提虫草素,然后设计单因素试验和正交试验,通过离子交换层析进行分离。结果表明:洗脱流速、料水比为主要影响因子。最优条件为:料水比1∶16,洗脱流速为30滴/min,离子柱pH 3.5,此时虫草素的得率为0.014 2%。     

稻瘟菌Rac1蛋白的原核表达与纯化

Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)是Rho族蛋白主要成员,在稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)的侵染致病过程中发挥重要作用.本研究目的是采用结构生物学的方法进一步探究Rac1结构与功能以及与其他蛋白互作的机制,进一步阐释其致病机制.试验以稻瘟菌的cDNA为模板,根据Ras相关的C3肉毒素底物1基因(MoRac1)序列设计特异性引物进行PCR扩增,克隆了MoRac1基因并构建原核表达载体pHAT2-Rac1,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-PAGE检测与Western blot分析表明,pHAT2-Rac1在BL21(DE3)中表达,大小为25kD.通过亲和层析、离子交换与分子筛对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白.该蛋白的表达与纯化对其结构功能的研究奠定了基础.     

禾谷镰刀菌14α-脱甲基酶的原核表达与纯化

近年来,三唑类杀菌剂成为生产上防治小麦赤霉病(Fusarium Head Blight,FHB)的主要药剂,主要作用于甾醇生物合成中的14α-脱甲基酶(CYP51),使真菌麦角甾醇的合成受阻,从而破坏细胞膜功能,起到杀菌的功能.本研究的目的是采用结构生物学的方法探究禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)中14α-脱甲基酶(FgCYP51B)的三维结构、生化功能以及其与三唑类杀菌剂的互作机制,进一步阐释禾谷镰刀菌对三唑类杀菌剂潜在的抗性风险.以禾谷镰刀菌(F.graminearum)的cDNA为模板,根据14α-脱甲基酶基因(FgCYP51B)序列设计特异性引物进行PCR扩增,克隆了FgCYP51B基因并构建了3个全长表达载体pHAT2-CYP51B、pETM-20-CYP51B和pETM-30-CYP51B以及3个蛋白截短体表达载体pHAT2-CYP51B50-527,pETM-20-CYP51B50-527和pETM-30-CYP51B50-527,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3),并利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.结果表明:全长FgCYP51B蛋白在BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中均不表达;重组蛋白pHAT2-CYP51B50-527在大肠杆菌中不表达,而重组蛋白pETM-20-CYP51B50-527和pETM-30-CYP51B50-527成功表达,并通过亲和层析、离子交换与分子筛对重组蛋白进行纯化.该蛋白的表达与纯化为其结构功能的研究奠定了基础.     

红稗多糖的分离纯化工艺

为研究红稗粗多糖不同的脱蛋白工艺,并确定DEAE-52纤维素交换层析柱纯化分离红稗多糖的最优条件。用Sephadex G-100柱层析分离纯化得到的红稗多糖并采用柱前衍生化高效液相色谱法对纯化后的红稗精多糖的单糖组成种类进行测定。结果表明:红稗粗多糖的最佳上样浓度为5 mg/mL,洗脱速度0.5mL/min,上样体积25mL;采用Sevage法除蛋白3次,得到的蛋白清除率以及多糖保存率均较高,通过DEAE-52纤维素的柱层析分离纯化后可得到大组份多糖;再由Sephadex G-100柱层析分离纯化得到的大组份红稗中性多糖;再利用柱前衍生化高效液相色谱法(HCLP)测定分离纯化后的红稗多糖主要由L-鼠李糖(rhamnose,Rham)、D-葡萄糖醛酸(glucuronic acid,Glu)和葡萄糖(glucose,Glc)3种单糖组成。     

中药蒲黄纤溶蛋白的分离纯化及部分性质

用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析从中草药蒲黄中分离纯化一种纤维蛋白溶解酶,用纤维蛋白板检测分离后组分的纤溶蛋白活性,天然电泳检测分离效果,分离后得到了比活力为25.29的单一组分,SDS电泳确定该组分的表观分子量为31 000 D,同时比较了不同蛋白酶抑制剂对该组分的抑制作用。结果表明:该组分的纤维蛋白水解酶活性被PMSF、亮抑肽素、抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制剂以及苯甲脒强烈抑制,表明该粗提物中的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族。