基于PCR-LFB的羊源性成份检测方法建立

为建立基于样品DNA快速制备、PCR-LFB的羊源性成份检测技术,为动物源性成份的检测提供新思路。方法:进行动物源性成份DNA快速提取;针对绵羊线粒体基因组序列设计基因特异性引物及探针进行PCR扩增;制备LFB对羊源性成份核酸扩增物进行检测。结果:样品DNA快速制备技术操作简单、耗时少;PCR-LFB对羊基因组DNA检测灵敏度为常规琼脂糖凝胶电泳的10倍,特异性为100%,对9种商业化羊肉样品均可检出。结论:建立的羊源性成份PCR-LFB检测技术,具有简单、快速、准确的特点。     

基于PCR-LFB的羊源性成份检测方法建立

为建立基于样品DNA快速制备、PCR-LFB的羊源性成份检测技术,为动物源性成份的检测提供新思路。方法:进行动物源性成份DNA快速提取;针对绵羊线粒体基因组序列设计基因特异性引物及探针进行PCR扩增;制备LFB对羊源性成份核酸扩增物进行检测。结果:样品DNA快速制备技术操作简单、耗时少;PCR-LFB对羊基因组DNA检测灵敏度为常规琼脂糖凝胶电泳的10倍,特异性为100%,对9种商业化羊肉样品均可检出。结论:建立的羊源性成份PCR-LFB检测技术,具有简单、快速、准确的特点。     

基于PCR-LFB的羊源性成份检测方法建立

为建立基于样品DNA快速制备、PCR-LFB的羊源性成份检测技术,为动物源性成份的检测提供新思路。方法:进行动物源性成份DNA快速提取;针对绵羊线粒体基因组序列设计基因特异性引物及探针进行PCR扩增;制备LFB对羊源性成份核酸扩增物进行检测。结果:样品DNA快速制备技术操作简单、耗时少;PCR-LFB对羊基因组DNA检测灵敏度为常规琼脂糖凝胶电泳的10倍,特异性为100%,对9种商业化羊肉样品均可检出。结论:建立的羊源性成份PCR-LFB检测技术,具有简单、快速、准确的特点。     

基于PCR-LFB的羊源性成分检测方法建立

为建立基于样品DNA快速制备、PCR-LFB的羊源性成分检测技术,为动物源性成分的检测提供新思路。进行动物源性成分DNA快速提取,针对绵羊线粒体基因组序列设计基因特异性引物及探针进行PCR扩增,制备LFB对羊源性成分核酸扩增物进行检测。结果表明:样品DNA快速制备技术操作简单、耗时少;PCR-LFB对羊基因组DNA检测灵敏度为常规琼脂糖凝胶电泳的10倍,特异性为100%,对9种商业化羊肉样品均可检出。建立的羊源性成分PCR-LFB检测技术,具有简单、快速、准确的特点。     

鹅源性成分PCR检测方法的建立

[目的]建立一种检测鹅源性成分的PCR方法。[方法]以15种动物的DNA为模板,利用鹅的特异性引物进行PCR反应,PCR产物用1．4％的琼脂糖凝胶电泳检测并测序,检测引物的特异性和敏感性。[结果]通过PCR反应从鹅样品中扩增到了304bp的目的片段,其他物种火鸡、鸭、鸽鹑、鸵鸟、鸽子、鸡、马、牛、羊、猪、狗、驴、猫、鱼和空白对照则无目的片段,表明该引物的特异性良好。鹅组织PCR产物的核苷酸序列与GenBank中检索到的相应序列基本符合,相似性为98％;PCR检测方法的检测灵敏度为0．01％。[结论]该PCR检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高、可重复性好,为明确食品与饲料的成分和来源,预防禽流感的传播提供了有效的分子生物学捡测方法.     

羊源沙门氏菌耐药性和耐药基因的检测

为掌握新疆某养殖场羊源沙门氏菌对常用抗菌药物的耐药情况,并了解其携带部分相关耐药基因的流行现状及β-内酰胺酶、16SrRNA甲基化酶和喹诺酮类耐药基因(Plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)的共存情况。使用琼脂稀释法对分离的沙门氏菌进行药敏试验,通过PCR方法进行blaTEM、blaCMY-2、blaCTX-M、blaLAP-1、blaKPC、blaOXA、blaSHV等β-内酰胺酶和armA、rmtB等16SrRNA甲基化酶及qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib-cr等PMQR基因检测,分析阳性菌株携带的基因型与耐药表型之间的关系。结果显示新疆该羊养殖场分离的沙门氏菌对被检的12种抗菌药物耐药率超过80%的有6种。47株菌携带blaTEM基因,34株菌携带blaOXA基因;未检出armA和rmtB等16SrRNA甲基化酶。33株菌携带qnrS,46株菌携带oqxA,46株菌携带oqxB,47株菌携带acc(6′)-Ib-cr基因。新疆该养殖羊场分离株耐药现象严重,携带耐药基因以blaTEM、blaOXA、qnrS、aac(6′)-Ib-cr、oqxA和oqxB为主,耐药基因型复杂多变、呈多样化发展,应该加强对β-内酰胺酶及PMQR因子的监控。     

饲料中羊源组织成分的PCR检测

应用Chelex-100快速提取动物基因组DNA的方法,并根据羊线粒体基因的核苷酸序列设计1对引物,通过对分离的DNA进行PCR扩增、基因克隆及核苷酸序列分析,实现了对动物源性饲料中羊组织成分的检测.结果显示,该方法对羊组织DNA检测的敏感性可达20.16 pg/μL,当肉骨粉样品中含有质量分数为0.050%的羊源性成分时仍能检出,整个过程约需3 h.     

基于nuc基因的奶牛乳房炎性金黄色葡萄球菌PCR检测方法的建立

基于PCR扩增的高效性,建立了以耐热核酸酶基因(nuc)为靶标基因特异性检测奶牛乳房炎性金黄色葡萄球菌的PCR方法。本实验从分离获得的205株染色为革兰阳性、形态为葡萄串状的菌株中随机选取50株进行16S rRNA基因测序和nuc基因扩增。结果显示,其中有40株葡萄球菌均可扩增出约279 bp的条带,其余10株葡萄球菌均未扩增出预期大小的条带。传统生化鉴定及16S rRNA基因测序结果表明,40株扩增出约279 bp条带的分离株均为金黄色葡萄球菌,未扩增出预期大小条带的10株菌均是葡萄球菌属的其它种。这一结果表明,nuc基因的PCR扩增可作为金黄色葡萄球菌特异性检测的分子标记。     

应用两种PCR方法检测饲料中牛、羊源性成分

对普通PCR和实时(realtime)PCR两种方法在饲料中牛、羊源性成分检测中的应用进行了比较。分别设计并合成相应的引物和探针,对饲料中的牛、羊源性成分进行检测。结果表明,用普通PCR最低可以从饲料中检出0.1%的牛、羊源性成分,realtime PCR最低可以从饲料中检出0.01%的牛、羊源性成分。     

快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒方法的建立

为研究建立快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的PT-PVR方法。结合GenBank中HEV涉及的HE基因及S基因设计1对引物,整理RT-PCR的反应条件,建立(HEV)RT-PCR方法。结果发现,检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)的RT-PCR方法存在一定的特异性和敏感性,可以检测到猪体内多个组织内含有该病原。表明检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)的RT-PCR方法的建立具有实际意义,可有效检测猪血凝性脑脊髓炎病毒。     

检测禽多杀性巴氏杆菌PCR方法的建立

为禽多杀性巴氏杆菌感染提供特异、敏感的诊断方法,本研究建立了检测禽多杀性巴氏杆菌PCR方法.该方法能从禽多杀性巴氏杆菌扩增出1条460 bp的特异片段,而无法从大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、禽1型副黏病毒、番鸭呼肠孤病毒和鸭基因组DNA扩增出目的片段.敏感性试验显示该PCR方法最低可检测出1 ng·L-1的细菌基因DNA.     

黏附与脱落性大肠杆菌PCR快速检测方法的建立

利用PCR方法扩增黏附与脱落性大肠杆菌(AEEC)的紧密素eaeA基因,并对不同来源的样本以增菌培养、选择性培养和PCR方法进行分离鉴定,旨在建立AEEC的PCR快速检测方法体系.结果表明,PCR方法可检测出肠出血性大肠杆菌(EHEC)和肠致病性大肠杆菌(EPEC),而其他类型的大肠杆菌和非大肠杆菌均未出现特异性的片段,该PCR体系能检测出12pg的模板DNA.同时基于EHEC和EPEC的eaeA、bfpA、stxl、stx24个基因建立了多重PCR检测方法,可以快速区分出EHEC、典型EPEC和非典型EPEC.本PCR法对于AEEC的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作的优点,在实践中具有很大的推广价值.     

基于I-FABP的鲫肠道通透性检测方法的建立

肠道通透性与肠道稳态及个体健康状况直接相关,目前尚缺乏鱼类肠道通透性的定量评价方法及试剂。血清中肠脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein,I-FABP）是肠道通透性的重要血清生物学指标,可用于肠道通透性的定量评价。为建立鲫（Carassius auratus）血清I-FABP的定量检测方法,克隆了鲫I-FABP基因,经原核表达和纯化,并利用重组蛋白分别免疫新西兰白兔（New Zealand white rabbit）及小鼠（Mus musculus）,制备了兔源及鼠源多克隆抗体,其效价均为1∶80 000。以纯化的兔源多克隆抗体作为包被蛋白,以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的鼠源多克隆抗体作为酶标抗体,通过优化各反应条件建立了基于鲫I-FABP的双抗体夹心酶联免疫检测方法（double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA）。标准曲线的线性回归方程为y=0.003 5x+0.036 7,拟合度较高R²为 0.999 1,临界值为0.090 6。批内及批间变异系数分别为1.17%～5.50%及0.16%～4.78%,具有较好的重复性。以该方法对54份样品进行检测,与商业化试剂盒对比,符合率为100%。构建的DAS-ELISA检测方法可用于鲫肠道通透性的定量评估。鉴于鱼类I-FABP的保守性,该方法或可用于其他鱼类肠道通透性的定量评价。     

LAMP检测沙门氏菌方法的建立

环介导等温扩增(LAMP)是利用设计的4条特殊引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。研究选取沙门氏菌编码DNA解旋酶B亚单位的gyrB基因设计了1套引物,总反应体系25μL,63℃恒温1 h,用LAMP对9株沙门氏菌属扩增的结果均为阳性,而大肠杆菌O216等7株致病菌株扩增的结果均为阴性;LAMP的灵敏度为6.8×101cfu/mL。LAMP检测方法更快速、灵敏,有着较为广泛的发展前景。     

转基因番木瓜检测方法的建立

正番木瓜(Carica papaya)是一种有较高食用和药用价值的草本果树,番木瓜蛋白酶广泛应用于医药、美容、日化品等行业[1]。番木瓜环斑花叶病毒(PRSV)是危害番木瓜生产的一种世界性病毒,植株受到侵染后,无法进行有效治疗,目前的化学杀菌剂不能有效控制其蔓延[2]。培育抗病品种是防治环斑花叶病毒最紧迫的任务之一,但番木瓜栽培品种中缺乏有效抗病基因资源[3]。直到1986年,Abel等[4]报道了     

狂犬病毒RT-PCR检测方法的建立

根据狂犬病毒保守序列设计引物,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)建立了一种检测狂犬病毒的方法,以期实现对严重危及人和动物生命安全的狂犬病毒直接检测。     

LAMP检测沙门氏菌方法的建立

环介导等温扩增(LAMP)是利用设计的4条特殊引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。研究选取沙门氏菌编码DNA解旋酶B亚单位的gyrB基因设计了1套引物,总反应体系25μL,63℃恒温1 h,用LAMP对9株沙门氏菌属扩增的结果均为阳性,而大肠杆菌O216等7株致病菌株扩增的结果均为阴性;LAMP的灵敏度为6.8×101cfu/mL。LAMP检测方法更快速、灵敏,有着较为广泛的发展前景。     

基于毛细管电泳的7种猪源性疫病的多重PCR检测方法的建立

为建立一种基于毛细管电泳技术,可同时高效地检测7种常见猪源性疫病(猪链球菌、猪瘟病毒、日本脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、猪轮状病毒、沙门氏菌)的高通量快速检测方法,本研究将多重PCR与毛细管电泳相结合,针对各毒株基因保守序列分别设计7对特异性引物,在每条引物的5'端加上通用引物标签序列,构成特异性嵌合...     

基于双特异纳米抗体FMDV血凝检测方法的建立

本研究利用基因工程方法将抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,其相对分子质量为3.5×10⁴,能同时与FMDV和cRBC反应。利用Nb205-48成功建立了可用于FMDV抗原检测的血凝方法,该方法检测灵敏度为1μg/ml,与其他病毒无交叉反应,且批内和批间重复性好。分别采用血凝法和夹心ELISA方法对3批次FMDV抗原进行了检测,二者检测结果基本吻合。本研究建立了基于双特异纳米抗体Nb205-48的血凝检测方法,该方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性,且简便、快捷、成本低,其检测结果与传统的FMDV定量检测方法的检测结果相关性好,为检测口蹄疫疫苗生产过程中FMDV抗原的含量提供了新方法。