幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为快速鉴别诊断蜜蜂美洲幼虫腐臭病(American foulbrood,AFB)和欧洲幼虫腐臭病(European foulbrood,EFB),本研究根据Gen Bank中登录的幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)和蜂房蜜蜂球菌(Melissiciccus pluton)16S r RNA基因序列分别设计特异性引物和探针,建立了双重Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法与其他病原无交叉反应;对P.larvae和M.pluton的检测灵敏度均达10 copies/μL的阳性质粒;重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于2%。应用该方法对200份实验室模拟样品和200份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可用于AFB与EFB的快速鉴别诊断和早期监测,以及蜂产品中P.larvae和M.pluton的定量分析。     

蜜蜂蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测蜜蜂欧洲幼虫腐臭病(EFIB)病原菌蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)的方法,本研究根据M.pluton 16S rRNA基因序列,设计并合成特异性引物和TaqMan探针,经反应参数优化,建立了检测M.pluton TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该方法与其它蜜蜂常见病病原均无交叉反应;该方法的灵敏度为1.0×10~1拷贝/μL的阳性质粒,比普通PCR灵敏1 000倍;重复性试验表明该方法的批内和批间变异系数均小于1%。应用该方法对100份实验室模拟样品和150份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可为蜂及蜂产品中M.pluton的检验检疫提供新的、有效的技术手段。     

蜜蜂幼虫芽孢杆菌微滴式数字PCR检测方法的建立

为建立新型高灵敏度的幼虫芽孢杆菌微滴式数字PCR (droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,针对幼虫芽孢杆菌16S rRNA基因设计特异性引物和探针。通过对反应体系优化,建立幼虫芽孢杆菌ddPCR检测方法,并对方法的灵敏度、线性关系、特异性及重复性进行评估。结果:建立的方法与其他6株非幼虫芽孢杆菌无交叉反应,具有良好的特异性;线性关系良好(R^2=0. 991 4);灵敏度为2. 9 copies/μL; ddPCR检测的相对标准偏差(RSD)在0. 93%～5. 27%,重复性好。试验表明本研究建立的ddPCR方法可以对幼虫芽孢杆菌进行绝对定量检测。     

鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量PCR方法的优化

为提高鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan荧光定量PCR方法的敏感性和简化反应条件,本研究在前期建立的TaqMan荧光定量PCR方法的基础上,设计一条特异性的反转录引物,优化反应体系,建立了简便、快速、敏感的TaqMan荧光定量PCR方法。该荧光定量PCR方法最低检测限为10拷贝,敏感性是未优化的荧光定量PCR方法的5倍、是普通PCR方法的100倍,并且该方法对DTMUV的最低检测限是0.01半数鸡胚致死量(ELD50)。通过批内和批间实验的变异系数表明优化的荧光定量PCR方法的重复性比未优化的荧光定量PCR方法好。通过该优化的荧光定量PCR方法检测其它常见的鸭病病毒的DNAs或RNAs,证明了该方法特异性好。对现地60份疑似DTMUV的样品进行检测,用该方法检出57份样品为阳性,明显高于普通PCR,并且在区分35Ct值左右样品试验中敏感性优于未优化的荧光定量PCR方法。该优化的DTMUV TaqMan荧光定量PCR方法更适用于DTMUV的快速定量流行病学诊断。     

Taqman-MGB探针法检测炭疽杆菌

根据GenBank中炭疽杆菌的主基因组上gyrA基因,毒力因子px01上pagA基因和侵袭因子px02上的CapA基因分别设计引物和对应Taqman-MGB探针,建立了检测炭疽杆菌的实时定量PCR方法。该方法具有良好特异性,仅对炭疽杆菌检测结果为阳性,而与蜡样芽孢杆菌、苏云金杆菌、巨大芽孢杆菌、沙门菌、大肠杆菌、链球菌、铜绿假单孢杆菌无交叉反应,检测灵敏度最低可达100copies/μL。对24份皮毛盲样和120份送检样品检测结果表明建立的定量PCR方法与商业化定量PCR试剂盒的符合率为100%。Taqman-MGB探针方法灵敏、特异、重复性好,可应用于炭疽杆菌的快速诊断与监测。     

布氏杆菌和结核杆菌二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

本试验旨在利用二重实时荧光定量PCR技术建立鉴别诊断布氏杆菌和结核杆菌的方法。通过筛选布氏杆菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和结核杆菌cfp10基因的最佳引物组合,建立二重实时定量PCR鉴别诊断方法,对该方法进行稳定性、特异性和敏感性试验,并对临床样品及模拟样品进行检测。经筛选布氏杆菌的omp25基因与结核杆菌cfp10基因引物组合最佳,该二重实时荧光定量PCR方法中布氏杆菌Tm值为88～89℃,结核杆菌Tm值为90～91℃,对其他供试的菌株则为阴性;该方法对布氏杆菌的DNA最低检出量为20拷贝.μL-1,结核杆菌为50拷贝.μL-1,两病原都存在时为100拷贝.μL-1,比常规PCR高100倍。利用所建立的二重荧光定量PCR方法及常规PCR,对24份结核痰样、11份布氏杆菌基因粗提物及30份模拟奶样进行检测,符合率为100%。本试验建立的方法可用于同时检测布氏杆菌和结核杆菌,并且具有良好的特异性、敏感性和稳定性。     

检测鼻气管鸟疫杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立

利用DNAStar对GenBank上发布的鼻气管鸟杆菌(ORT)16S rRNA基因进行序列分析,根据分析结果选择其保守区域设计1对特异性的引物。扩增16SRNA部分保守基因序列并将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,经鉴定、纯化后作为阳性标准品,用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线的建立。反应条件反复优化后,成功建立了检测ORT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法对ORT的最低检测量约为100拷贝数/μL,比普通PCR高100倍;与引起禽类呼吸系统疾病的其他病原体之间无交叉反应;批内和批间试验的变异系数均小于0.63%,充分显示该方法具有良好的重复性和稳定性。对46份临床样本进行ORT检测,该方法检测的阳性样本为38份,检出率为82.26%。在38份阳性样品中,普通PCR只检出30份阳性样品,常规细菌培养只检出23份阳性样品。结果表明:本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法比其他方法更敏感,为临床上快速准确的检测、诊断禽类ORT的感染提供了敏感可靠的检测方法。     

鼠轮状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据鼠轮状病毒(Murine rotavirus,MRV)EB-C8/G16P毒株VP1基因(GenBank登录号:KJ477127.1),设计引物和Taq Man探针,确定标准曲线,建立MRV荧光定量PCR方法,检测其特异性、敏感性和稳定性。结果显示,建立的MRV荧光定量PCR方法标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99;最低可检测到10 copies/μL,是常规PCR的100倍;与常见的小鼠病毒株均无特异性扩增;批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重复性好。将建立的荧光定量PCR初步对246份小鼠肠道样品病料进行检测,结果均为阴性。本研究建立的MRV荧光定量PCR方法特异性、灵敏性良好,可为鼠轮状病毒的流行病学调查、检测以及制定国家标准和地方标准提供可靠的数据和适用的监测方法。     

猪丹毒杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感的检测猪丹毒杆菌方法,本研究根据猪丹毒杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了检测猪丹毒杆菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明:以重组质粒为标准品建立的标准曲线在7.66×108拷贝/μL~7.66×10拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;最低可以检测到7.66×10拷贝/μL的标准品阳性质粒;该方法与其他22种常见细菌均无交叉反应;批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的方法和细菌分离鉴定方法分别对36份临床样品进行检测,阳性率分别为19.44%和11.11%,两者符合率为91.67%。本研究建立的方法可用于猪丹毒杆菌感染的早期诊断、临床样品的高通量快速诊断检测以及猪丹毒杆菌定量分析。     

猪Hokovirus TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立检测PHoV的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据PHoV的VP2基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有VP2基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果显示,该方法的检测灵敏度为10拷贝;而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3.29％,表明该方法的重复性较好.对华东地区采集的225份临床样品进行检测,结果显示,PHoV的阳性率为14.2％.本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可以为PHoV的流行病学调查和发病机制等研究提供可靠的工具.     

多杀性巴氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种多杀性巴氏杆菌(Pm)快速敏感的检测方法,本实验根据Pm70株kmt1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了该菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并优化了检测反应条件。本实验建立的荧光定量PCR方法可以特异性检测Pm,而对鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等菌株检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。该方法对C48-1株标准品的检测灵敏度为1.75×10~1拷贝/μL,优于常规PCR检测方法(1.75×10~3拷贝/μL) 100倍;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对20份疑似感染的临床病料样品(鸡肝脏、牛肺脏)进行增菌培养和分离鉴定,结果分离到8株多杀性巴氏杆菌;以建立的荧光定量PCR方法与常规PCR方法对增菌培养液进行检测,阳性率分别为40%(8/20)和25%(5/20),且荧光定量PCR方法与常规细菌分离鉴定的符合率为100%。对C48-1株感染致死的20份小鼠肝脏和脾脏组织研磨液进行检测,阳性率均为100%。本研究建立的方法能够快速、敏感的检测Pm,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义。     

化脓隐秘杆菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本试验旨在建立检测化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes,A.pyogenes)特异、灵敏的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank公布的化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)基因高保守序列,设计特异性引物和探针建立检测体系,用于化脓隐秘杆菌的快速检测,并对该方法的特异性和灵敏度进行检测。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法仅对化脓隐秘杆菌的检测结果为阳性;该方法最低检测DNA浓度为77.6 fg,最低检测细菌浓度为63 CFU/mL。采用本研究建立的方法检测23份林麝临床病例样品,共鉴定出16株化脓隐秘杆菌,与API Coryne生化鉴定方法的结果相同。本研究为化脓隐秘杆菌的检测提供了一种灵敏、特异、快速的检测方法,其可用于化脓隐秘杆菌的诊断和流行病学调查。     

炭疽杆菌RPA等温检测方法的建立和应用

为建立一种简单、快速的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)分子检测方法,本研究基于炭疽杆菌BA5345基因保守序列,设计合成1对重组酶聚合酶扩增(RPA)引物,通过对反应时间的优化,建立39℃恒温水浴锅检测炭疽杆菌的RPA方法。结果显示,所建立的RPA方法在39℃水浴锅中恒温反应30 min,能够特异性的检测炭疽杆菌;以重组质粒pUC57-BA5345作为模板,RPA方法对其检测下限为102拷贝/μL,与荧光定量PCR检测试剂盒检测下限一致,比常规PCR方法敏感性高100倍;RPA方法对污染皮毛临床样品的阳性检出率为65.71%,略低于荧光定量PCR试剂盒的检出率(71.43%),明显高于常规PCR的检出率(42.86%)。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速,结果确实可靠,适用于炭疽杆菌的快速检测。     

猪圆环病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL～4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

荧光定量RT-PCR检测公猪精液和血液中猪瘟病毒载量

为快速检测规模化猪场猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),本研究参考GenBank中登录的CSFV序列设计引物,利用实时荧光PCR技术,构建重组质粒作为阳性标准品,建立特异、敏感、重复性好的CSFV快速定量检测方法.同时建立标准曲线,用于对猪瘟病毒的定量分析.本方法对规模化猪场的100份抗凝血和50份公猪精液样品进行检测,常规PCR检出27份占18％,荧光定量PCR检出123份占82％.表明荧光定量RT-PCR方法在检测猪瘟样品中具有潜在的应用价值,同时可检测猪群中猪瘟病毒持续性感染的状态存在.     

副猪嗜血杆菌及巴氏杆菌双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立副猪嗜血杆菌(Hps)、多杀性巴氏杆菌(Pm)的双重荧光定量PCR检测方法,本研究基于Hps的Omp P2基因,Pm的PlpE基因设计两对特异性引物及探针,通过对反应条件优化,建立了一种同时检测Hps及Pm的双重荧光定量PCR方法。该方法能够特异性地检测Hps和Pm,其对重组质粒标准品的最低检测浓度分别为5.60×10^2拷贝/μL、7.58×10^2拷贝/μL。双重与单一荧光定量PCR最低检测限相同,且均是常规PCR的100倍。重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于2.5%。临床应用结果显示:该方法对阳性样品的检出率为53.57%,明显优于常规PCR和细菌分离鉴定。该方法能够用于两种疾病的同时检测和快速排查疾病。为两种疾病的防治提供有效检测工具。     

用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10~(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。     

羊痘病毒属病毒多重TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时快速鉴别检测羊痘病毒属病毒(CaPV)的方法,本研究设计了一对针对CaPV的通用引物和3条特异性的TaqMan MGB探针,并对其反应条件进行优化,建立了单管同时鉴别检测3种病毒的多重TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该多重荧光定量PCR方法仅对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)有特异性扩增,而对牛痘病毒等其它相关病毒核酸无扩增。在10~2拷贝/μL～107拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系;对LSDV、 GTPV、SPPV的最低检测限分别为14.8拷贝/μL、32.9拷贝/μL、26.7拷贝/μL。标准曲线相关系数(R2)均为0.999。批内及批间变异系数均小于1.5%。应用本研究建立的方法和OIE陆生动物手册推荐普通PCR方法分别对185份临床样品和67份模拟样品进行检测,该方法检出率比普通PCR方法高约1.6%。本研究建立的CaPV多重TaqMan-MGB荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便快速等优点,适用于CaPV临床样品的快速鉴别检测。     

马疱疹病毒1型QuantStudio~(TM)3D数字PCR检测方法的建立

试验旨在建立一种高灵敏性的马疱疹病毒1(EHV-1) 3D数字PCR(3D-dPCR)检测方法,对EHV-1病毒含量较低的样品能准确定量检出,实现马鼻肺炎早期诊断及预防。根据EHV-1糖蛋白B基因保守区域设计特异性引物和探针,优化3D-dPCR反应体系中引物探针浓度和退火温度,对该方法进行灵敏性、特异性、重复性分析,建立了EHV-1的3D-dPCR方法。本研究建立的3D-dPCR方法,引物和探针最佳浓度分别为0.4和0.4μmol/L,最佳退火温度为60℃,该方法绝对定量曲线的R~2=0.998,线性关系良好,与实时荧光定量PCR方法相比灵敏度高10倍左右,最低检出限为5.83拷贝/μL;批内和批间重复性试验变异系数均3.2%;与EHV-4、马泰勒虫、马病毒性动脉炎的核酸无交叉反应;通过对123份临床样品进行3D-dPCR检测,结果显示,3D-dPCR方法阳性检出率为66.7%,高于世界动物卫生组织(OIE)中EHV-1的实时荧光定量PCR方法阳性检出率64.2%。3D-dPCR方法对病毒含量较高的样品与实时荧光定量PCR结果一致,对病毒含量较低的样品敏感性更高,能有效检出可疑样品。本试验结果表明,建立的3D-dPCR方法检测低拷贝数的临床样品时灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于EHV-1的准确定量检测。     

猪戊型肝炎病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪戊型肝炎病毒(SHEV)的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究根据SHEV基因ORF2保守区设计引物及探针,并对PCR反应条件进行优化。结果表明,该方法扩增的相关系数可达0.999,在102拷贝/μL~109拷贝/μL内具有良好的线性关系。对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和伪狂犬病毒的RNA或DNA进行检测,结果均为阴性。该方法可以检出最低拷贝数为10拷贝/μL。重复性试验结果表明该方法的批内和批间变异系数均小于3.0%。本研究使用该荧光定量PCR检测方法对黑龙江省临床收集的131份样品(肝脏45份、粪便86份)进行检测,总阳性率为11.45%,其中肝脏阳性率为22.22%,粪便阳性率为5.81%。该方法的建立为SHEV的快速检出及绝对定量奠定了良好的基础。