基于重组酶介导等温扩增技术的羊口疮病毒核酸检测方法的建立及初步应用

为建立羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)核酸的快速检测方法，本研究根据ORFV B2L基因保守序列设计特异性引物，通过优化反应温度与时间初步建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的ORFV检测方法。优化试验结果显示：该方法在37℃反应40 min检测效果最佳。采用该方法对ORFV、山羊痘病毒、O型和A型口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、山羊副流感病毒3型等临床常见症状相似的病毒核酸检测，结果显示：该方法除对ORFV的检测结果为阳性外，对羊的其他病毒的检测结果均为阴性，特异性较强。将质粒标准品10倍倍比稀释(1×10⁹拷贝/μL～1×10⁰拷贝/μL)后为模板，利用本研究建立的RAA方法检测，结果显示：该方法对ORFV质粒标准品的最低检测限为1×10⁴拷贝/μL，敏感性较高。利用本研究建立的方法对95份临床样品(15份组织样品和80份血液样品)检测，结果显示：该RAA方法能够对临床样品快速检测，组织样品和血液样品的阳性率分别为33.33%(5/15)和6.25%(5/80)，该检测结果与普通PCR检测方法的符合率均为...     

同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为建立可以同时检测多杀性巴氏杆菌(Pm)及其荚膜A型的快速敏感检测方法,本研究在建立的Pm kmt1基因的荧光定量PCR基础上,设计了该菌capA基因特异性引物和Taq Man探针,经优化反应条件建立了双重Taq Man荧光定量PCR检测方法。本实验从荚膜A型Pm C48-1菌株中扩增了capA基因,构建了重组质粒pMDcapA;以pMD-capA重组质粒为标准品,建立的标准曲线在9.83×10~3拷贝/μL～9.83×10~9拷贝/μL内与Ct值具有良好的线性关系,相关系数(R~2)为0.9873,扩增效率(E)为1.032。建立的双重荧光定量PCR方法可以同时检测Pm及其荚膜A型,而对B型、D型Pm、鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等细菌检测结果均为阴性,具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测灵敏度为101拷贝/μL,高于常规PCR检测方法(103拷贝/μL)100倍具有较高的敏感性;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有较好的重复性。本实验建立的双重荧光定量PCR方法可以同时快速敏感地检测Pm及其荚膜A型,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义。     

5种猪病毒性传染病病原的多重PCR检测方法的建立

为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、水疱性口炎病毒(VSV)、猪口蹄疫病毒(FMDV),猪瘟病毒(CSFV)以及猪伪狂犬病病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的参考病毒株序列,选择各病毒的保守序列设计5对特异性引物,通过优化反应条件,建立了一种可以同时快速检测以上5种病毒的多重RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对不同的细菌或病毒模板扩增结果均为阴性,特异性强;敏感性试验表明该方法对PRV、CSFV、ASFV、VSV和FMDV的核酸最少检出量分别为8.82×10~3拷贝/μL、6.87×10~4拷贝/μL、5.71拷贝/μL、4.93×10~4拷贝/μL和4.32×10~2拷贝/μL。以上结果表明该方法快速、灵敏、特异性强,对以上5种猪病病毒能够进行快速鉴别检测,为其临床诊断与流行病学调查提供了有效的检测方法。     

山羊痘病毒和羊口疮病毒双重PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank发表的山羊痘病毒（goatpox virus,GPV）和羊口疮病毒（orf virus,ORFV）基因序列,分别合成针对GPV ITR和ORFV H2L基因片段的2对引物,以GPV和ORFV的核酸混合物作为模板,经优化反应条件,成功建立了快速鉴别检测GPV、ORFV的双重PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对GPV与ORFV核酸的扩增能获得289和507 bp的特异性目的片段,而对FMDV、FPV、BTV、健康山羊皮肤的核酸扩增均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为4 pg,对ORFV核酸为0.4 pg;对临床采集的12份病料进行双重PCR扩增,GPV检出率为25%（3/12）,ORFV的检出率为75%（9/12）。结果表明,建立的双重PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和ORFV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。     

猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒3/4/5型双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪博卡病毒(PBoV)3/4/5型的双重PCR方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ORF1基因序列和PBoV不同基因型VP1序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测PEDV和PBoV3/4/5型双重PCR方法,特异性检测结果显示该方法对猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、猪链球菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对PEDV和PBoV3/4/5型重组质粒标准品的最低检出量分别为837拷贝/μL和1 000拷贝/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出PEDV和PBoV3/4/5型混合感染及单独感染。本研究建立的双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测PEDV和PBoV提供了技术帮助。     

猪瘟和猪伪狂犬野毒与其疫苗株多重PCR鉴别方法的建立

为建立一步法鉴别检测猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与其疫苗株感染的多重PCR方法(m PCR),本实验通过比对分析Gen Bank中登录的CSFV和PRV的相关基因序列分别设计可以区分CSFV与PRV及其疫苗株的5对特异性引物,建立了其多重PCR鉴别检测方法。结果表明,建立的多重PCR方法对CSFV和PRV扩增为阳性,而对PCV2、PRRSV、JEV和BVDV扩增结果均为阴性;最低核酸检测量分别为1.7×10~3拷贝/μL(CSFV野毒株)、9.9×10~3拷贝/μL(CSFV-C疫苗株)、1.3×10~3拷贝/μL Guizhou-DY)、6.9×10~3拷贝/μL(Bartha-K61)和5.5×10~3拷贝/μL(SA215)。采用该方法对134份可疑临床样品进行检测,结果表明CSFV和PRV疫苗株与野毒株在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的5重感染率分别为2.6%(1/38)、7.7%(2/26)、8.3%(3/36)和8.8%(3/34)。本研究建立的多重PCR方法为从病原学方面快速鉴别CSF和PR疫苗毒与野毒提供了新的技术支撑,为规模化猪场实现猪瘟与猪伪狂犬的净化提供一种新方法。     

羊痘病毒属病毒多重TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时快速鉴别检测羊痘病毒属病毒(CaPV)的方法,本研究设计了一对针对CaPV的通用引物和3条特异性的TaqMan MGB探针,并对其反应条件进行优化,建立了单管同时鉴别检测3种病毒的多重TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该多重荧光定量PCR方法仅对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)有特异性扩增,而对牛痘病毒等其它相关病毒核酸无扩增。在10~2拷贝/μL～107拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系;对LSDV、 GTPV、SPPV的最低检测限分别为14.8拷贝/μL、32.9拷贝/μL、26.7拷贝/μL。标准曲线相关系数(R2)均为0.999。批内及批间变异系数均小于1.5%。应用本研究建立的方法和OIE陆生动物手册推荐普通PCR方法分别对185份临床样品和67份模拟样品进行检测,该方法检出率比普通PCR方法高约1.6%。本研究建立的CaPV多重TaqMan-MGB荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便快速等优点,适用于CaPV临床样品的快速鉴别检测。     

鸡Caspase-1基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10~3拷贝/μL～1.0×10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10~2拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%～4.41%和0.37%～0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。     

禽腺病毒-Ⅰ群、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒多重PCR检测方法的建立

为快速检测禽腺病毒-Ⅰ群(FAV-I)感染,且能有效区分常见混合感染的新城疫病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV),本研究建立了多重PCR诊断方法。根据GenBank发表的FAV-Ⅰ的Hexon基因、NDV的F基因和IBV的N基因分别设计了3对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化建立多重PCR诊断方法,并对该方法进行了特异性和敏感性研究,且对临床样本进行检测。结果发现,本研究建立的多重PCR方法可准确扩增出大小为895 bp(FAV-I)、1 600 bp(IBV)和529 bp(NDV)的特异性片段;3种引物最佳浓度分别为3 pmol/μL、3 pmol/μL和6 pmol/μL,最佳退火温度为55℃;该方法对3种病毒的最低检测限分别为1.46×10~5拷贝/μL、8.93×10~2拷贝/μL和2.11×10~4拷贝/μL;且该方法不能扩增出减蛋综合征病毒、马立克病毒、鸡传染性贫血病毒和H9亚型禽流感病毒等,临床样品检测结果与单项PCR结果相同。表明本研究建立的多重PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可有效地区分FAV-I、NDV、IBV。     

牛星状病毒和牛诺如病毒双重PCR检测方法的建立及应用

为建立能同时快速检测牛星状病毒(BAstV)和牛诺如病毒(BNoV)的方法,本研究根据BAstV ORF1a基因和BNoV RdRp基因设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测BAstV和BNoV的双重PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对牛轮状病毒等5种犊牛腹泻常见病原的扩增结果均为阴性,仅BAstV和BNoV扩增结果为阳性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法对BAstV和BNoV重组质粒的最低检测限分别为1.09×10~3拷贝/μL和1.42×10~3拷贝/μL,敏感性较高;批内和批间试验结果一致,该方法重复性好。利用该方法和各病原单一PCR方法同时对221份河南省犊牛腹泻粪便样品进行检测,BAstV和BNoV的阳性检出率分别为18.1%和9.96%,两种方法符合率为100%。本研究在国内首次建立了检测BAstV和BNoV的双重PCR方法,其特异性强,敏感性高,重复性好,为BAstV和BNoV的鉴别检测及其分子流行病学调查提供了技术支持。     

绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种多重PCR检测方法的建立

为同时快速检测绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)和山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp),本研究根据Mo的P80基因,Mmc的MLC_1760和Mccp的arcA基因序列,设计合成了3对特异性引物,建立了同时检测Mo、Mmc和Mccp的多重PCR方法。该方法可以同时扩增出Mo、Mmc和Mccp的特异性片段,而对大肠杆菌、巴氏杆菌、羊传染性脓疱病毒等常见羊病病原无交叉反应,对Mo、Mmc和Mccp的最低检出量分别为3.62×10~4拷贝/μL、4.03×10~5拷贝/μL和6.78×10~5拷贝/μL。应用该方法对75份临床样品进行检测,结果与单一PCR检测结果一致。对32份临床样品同时用该多重PCR方法与分离鉴定法进行检测,结果显示,两种方法对Mo、Mmc、Mccp的检测符合率分别为87.5%、100%、100%。本研究建立的多重PCR方法特异性强、敏感性较高,适用于Mo、Mmc和Mccp临床快速检测及流行病学调查。     

猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×10⁸至2.0×10²拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。     

猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪细小病毒7型(PPV7)的快速定量检测方法,本研究根据PPV7(KU563733.1)基因序列设计一对特异性引物,扩增155 bp的PPV7衣壳蛋白基因,构建重组质粒pClon007-PPV7,以其作为标准品建立了PPV7的SYBR GteenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在5.00×10~9拷贝/μL~5.00×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该方法对猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、乙脑病毒、口蹄疫病毒常见病原的检测均无特异性扩增,仅PPV7出现特异性扩增;该方法检测灵敏度可达5.00×10~1拷贝/μL;批内和批间变异系数均低于1%,具有较高的重复性和稳定性。对临床样品的检测结果显示,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为71.88%,比普通PCR法检测的阳性率提高了约4.55%。该研究方法的建立为PPV7提供了一种新的快速定量检测技术。     

猪细小病毒2型、3型、6型多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立同时快速检测猪细小病毒2型(PPV2)、猪细小病毒3型(PPV3)、猪细小病毒6型(PPV6)的方法,本研究根据PPV2、PPV3、PPV6各自的NS基因序列设计3对特异性引物,建立了一种能同时检测上述病原的多重PCR方法。结果显示,建立的多重PCR方法对PPV2、PPV3、PPV6的基因组DNA均能有效扩增,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、日本乙型脑炎病毒(JEV)的核酸均无特异性扩增,特异性较强;对PPV2、PPV3、PPV6的重组质粒最低检测限分别为4.32×10^3拷贝/μL、9.62×10^3拷贝/μL、4.25×10^3拷贝/μL,与其他研究者已建立的单一PCR检测结果一致,敏感性较高。利用本研究建立的多重PCR方法对25份可疑临床样品检测,同时利用文献报道的单一PCR方法检测,二者结果一致。本研究建立的多重PCR方法为检测PPV,及该病的流行病学调查提供了技术支持。     

水禽圆环病毒双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测并区分鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)和鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)的方法,根据DuCV和GoCV基因组的保守区域设计两对特异性引物,预期特异性扩增DuCV和GoCV片段大小分别为192 bp、556 bp。经过反应条件的优化,建立了DuCV和GoCV的双重PCR检测方法。特异性检验表明该方法无法扩增其他水禽病原;DuCV和GoCV的最低检出限分别为10~4拷贝/μL和10~5拷贝/μL。临床样品检测结果显示,DuCV阳性率为8.01%,GoCV阳性率为1.6%,与常规PCR方法完全一致。结果表明,建立的双重PCR方法可以用于水禽圆环病毒检测和流行病学调查。     

鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体双重PCR检测方法的建立

为建立一种能同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的双重PCR方法,根据MG gapA基因和MS vlhA基因设计合成特异性引物,通过对双重PCR扩增条件的优化,建立能够同时检测MG和MS的双重PCR方法。结果显示,双重PCR反应条件中最适退火温度为58℃,反应体系中最适模板浓度为5.76ng/μL,最适引物量为1.25μL(10mmol/L)。特异性试验显示,所建PCR方法对MG、MS、MG/MS混合培养物均可扩增出相应的特异性条带,而对AIV疫苗、NDV疫苗、MO、E.coli、SE的基因组扩增结果均为阴性;敏感性试验显示,该方法对MS、MG最低检出核酸终浓度分别为0.045ng/μL和0.09ng/μL;临床应用性试验显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出MG和MS核酸。结果表明,该双重PCR具有良好的特异性、敏感性、临床应用性,可以用于临床病料中MG和MS的快速检测,为MG和MS感染的诊断和流行病学监测提供了一种简便适用的方法。     

水貂阿留申病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感检测水貂阿留申病毒(AMDV)的方法,本研究根据AMDV的VP2基因保守区设计特异性引物和MGB探针,并优化检测反应条件,建立了AMDV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在1.0×10~2拷贝/μL~1.0×10~8拷贝/μL内具有良好的线性关系,相关系数(R~2)为0.998。该方法仅对AMDV的靶基因扩增呈阳性,而对猪细小病毒、犬细小病毒、水貂肠炎细小病毒等相关病毒检测结果均为阴性,特异性良好。该方法对AMDV检测的灵敏度为10拷贝/μL,为普通PCR灵敏度的100倍;组内和组间重复性试验表明该方法的组内和组间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。应用建立方法和普通PCR方法分别对40份疑似临床组织病料样品进行检测,该方法检出率比普通PCR高约7.5%。本研究结果表明建立的AMDV TaqMan-MGB荧光定量PCR方法灵敏、快速、特异性强、重复性好,适用于对AMDV的快速定量检测。     

犬细环病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬细环病毒(TTCV)的快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的TTCV ORF7基因设计合成一对特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了检测TTCV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法 Ct值与标准品模板在5.82×10~9拷贝/μL~5.82×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该检测方法仅对TTCV检测为阳性,而对狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和犬副流感病毒均无特异扩增;该检测方法灵敏度可达5.82×103拷贝/μL。对27份犬血清样品检测结果显示,建立的荧光定量PCR阳性检测率为11.11%,而普通PCR方法检测阳性率为3.7%。本实验建立了TTCV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,对TTCV诊断及致病机制的研究提供了高通量的定量检测方法。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及初步应用

为建立能够检测猪博卡病毒(PBoV)所有基因型的检测方法,本研究根据PBoV每个基因群(G1、G2和G3)的保守区域设计特异性引物,建立了检测PB V的PCR方法。特异性试验结果显示除PBoV外,其它猪病病原核酸扩增均呈阴性,具有较强的特异性;对pMD-GD6、pMD-GD18和pMD-GD4的最低检测限分别为4.64×10~3拷贝/μL、5.29×10~3拷贝/μL和1.16×10~3拷贝/μL,敏感性较高;采用该方法对39头份猪的肝脏、肺脏、脾脏和小肠内容物进行检测,阳性率为74.4%(29/39)。其中G1群PBoV的检出率最高,G2群检出率最低;G1群和G3群在4种样品中均有检出,G2群只在小肠内容物中有检出;同时本研究首次在肝脏中检出该病毒。本研究结果表明,PBoV感染情况复杂,存在多基因型的混合感染。本研究为进一步对病毒进行基因分型和致病性研究提供检测依据。     

猪博卡病毒1/2型NS1基因与3/4/5型VP1基因的双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测不同基因型猪博卡病毒(PBo V)的PCR方法,本研究参考Gen Bank中登录的5种基因型PBo V1、PBo V2、PBo V3、PBo V4及PBo V5,设计了2对引物,通过对扩增条件进行优化,建立了PBo V1/2和PBo V3/4/5的双重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时扩增PBo V样品327 bp(PBo V1/2)和209 bp(PBo V3/4/5)的特异性片段,而对猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒等其他病原核酸扩增均为阴性。敏感性试验显示,该PCR方法对PBo V1/2和PBo V3/4/5的最低检出量分别为100拷贝/μL和1 000拷贝/μL。重复性试验显示该双重PCR检测方法具有良好的可重复性。应用该方法和单项PCR对30份临床样品进行检测,结果显示,同时感染PBo V1/2和PBo V3/4/5的阳性率为10%,并且两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适合对PBo V1/2和PBo V3/4/5的联合检测。