表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌微胶囊制备工艺的优化

为使重组乳酸乳球菌在发酵生产后便于存储、运输,本试验利用可表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363制备微胶囊,优化微胶囊的制备工艺条件,并对胶囊化后重组菌的相关生物学特性进行检测。通过对不同壁材及壁材浓度进行控制单一变量试验,测定其包埋量,以筛选出最佳壁材及浓度。通过模拟胃肠液环境试验,比较微胶囊释放率,并对不同壁材进行保存期试验,比较最低活菌数,利用响应面试验确定最佳工艺条件,使用最佳工艺条件制备微胶囊后进行验证。优化后的结果为:选取海藻酸钠和壳聚糖作为壁材,在海藻酸钠浓度为2.49%,壳聚糖浓度为0.96%,CaCl₂浓度为6.67%,凝固时间为57 min的条件下微胶囊效果最佳,预测包埋量为7.85×10⁸ CFU/g。微胶囊在模拟胃液中稳定存在,在模拟肠液中可完全破裂,能释放出微胶囊内95%以上的乳酸乳球菌。海藻酸钠-壳聚糖微胶囊在4 ℃保存3周后,微胶囊中活菌数为1.41×10⁷ CFU/g。对微胶囊的最佳工艺条件验证结果为微胶囊的包埋量为8.08×10⁸ CFU/g;常温保存2周后,活菌数仍可达到3.89×10⁶ CFU/g;ELISA方法检测微胶囊内重组乳酸乳球菌可见表达的牛乳铁蛋白肽,抑菌试验可见微胶囊内重组乳酸乳球菌表达的牛乳铁蛋白肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌仍具有明显的抑制作用。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌可制备成为低成本、保存期长、耐胃液的微胶囊,为重组乳酸菌在生产中的进一步应用奠定基础。     

表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究

为探究表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11对雏鸡抵抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的作用,本研究利用IBDVCEF94株感染DF-1细胞,通过CCK-8法检测病毒感染后的细胞活性,利用qRT-PCR检测病毒载量,结果显示重组乳酸菌表达的牛乳铁蛋白肽可以抑制IBDV在DF-1细胞内的增殖;以重组乳酸菌pPG-XLFEC/M11饲喂雏鸡,利用IBDV强毒UK661株进行攻毒实验,结果显示饲喂重组菌的雏鸡相比于对照组,IBDV的感染对其组织器官的损伤较小,总免疫球蛋白IgG和SIgA含量增加,细胞因子IL-6、IL-8、TNF-琢和IFN-酌以及TLR2的mRNA转录水平均显著升高,且提高了雏鸡的存活率。本实验结果表明,重组鸡源乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽可以增强机体的免疫应答水平,对雏鸡具有一定的抗IBDV感染的作用。本研究为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用以及为禽类疾病的预防奠定基础。     

两段牛乳铁蛋白肽基因在乳酸乳球菌中的共表达

根据乳酸乳球菌密码子的偏嗜性,优化设计并合成牛乳铁蛋白肽的两段基因序列LFcinB和LFampin,将其与乳酸乳球菌表达载体pAMJ399分别用SalⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接,并电转化至乳酸乳球菌MG1363中,经酶切鉴定表明获得带有两段牛乳铁蛋白肽基因的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363。结果表明,优化表达条件,在GM17培养基中添加3.8%的β-甘油磷酸二钠可以获得表达重组蛋白的适宜pH,West-ern-blot检测可见重组蛋白大小约13 ku,表明牛乳铁蛋白肽在重组乳酸乳球菌中获得了表达。     

表达猪乳铁蛋白肽重组屎肠球菌对断奶仔猪生长性能的影响及其抗ETEC感染效果研究

本试验以表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌（pNZ8112-PLFcin/Ef）饲喂断奶仔猪,研究其对仔猪生长性能的影响和抗产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）感染的效果。选取28日龄体重相近的健康断奶仔猪36头,随机分为3组（重组屎肠球菌组、空载体组和培养基组）,每组3个重复,每个重复4头仔猪。重组屎肠球菌组和空载体组分别饲喂添加pNZ8112-PLFcin/Ef （6×10¹² CFU/kg）和pNZ8112/Ef （6×10¹² CFU/kg）的基础日粮,而培养基组饲喂含有相同体积的GM17液体培养基的基础日粮。试验期26 d。结果显示,与培养基组相比,重组屎肠球菌组断奶仔猪的平均日增重极显著提高（P<0.01）;料重比显著降低（P<0.05）;腹泻率明显降低,肠道菌群的均匀度和多样性指数均下降。为进一步探究表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌对断奶仔猪抵抗ETEC感染的保护作用,在连续饲喂21 d后,每个重复中随机挑选1头体况相近的断奶仔猪灌服ETEC。结果发现,与培养基组相比,攻菌后重组屎肠球菌组断奶仔猪血清白细胞介素-2（IL-2）、免疫球蛋白G （IgG）含量、肠黏液中分泌型免疫球蛋白A （sIgA）水平均显著升高（P<0.05）;脾脏指数显著提高（P<0.05）,但胸腺指数、肠段长度及重量则均无显著差异（P>0.05）。综上所述,表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌能够起到促进断奶仔猪生长及抗ETEC感染的保护作用。     

表达猪乳铁蛋白肽重组屎肠球菌对断奶仔猪生长性能的影响及其抗ETEC感染效果研究

本试验以表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌(pNZ8112-PLFcin/Ef)饲喂断奶仔猪,研究其对仔猪生长性能的影响和抗产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)感染的效果。选取28日龄体重相近的健康断奶仔猪36头,随机分为3组(重组屎肠球菌组、空载体组和培养基组),每组3个重复,每个重复4头仔猪。重组屎肠球菌组和空载体组分别饲喂添加pNZ8112-PLFcin/Ef(6×1012 CFU/kg)和pNZ8112/Ef(6×1012 CFU/kg)的基础日粮,而培养基组饲喂含有相同体积的GM17液体培养基的基础日粮。试验期26d。结果显示,与培养基组相比,重组屎肠球菌组断奶仔猪的平均日增重极显著提高(P0.01);料重比显著降低(P0.05);腹泻率明显降低,肠道菌群的均匀度和多样性指数均下降。为进一步探究表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌对断奶仔猪抵抗ETEC感染的保护作用,在连续饲喂21d后,每个重复中随机挑选1头体况相近的断奶仔猪灌服ETEC。结果发现,与培养基组相比,攻菌后重组屎肠球菌组断奶仔猪血清白细胞介素-2(IL-2)、免疫球蛋白G(IgG)含量、肠黏液中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平均显著升高(P0.05);脾脏指数显著提高(P0.05),但胸腺指数、肠段长度及重量则均无显著差异(P0.05)。综上所述,表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌能够起到促进断奶仔猪生长及抗ETEC感染的保护作用。     

沙门氏菌鞭毛蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其免疫效果评价

为了开发基于乳酸乳球菌载体表达的新型沙门氏菌口服疫苗,试验按照乳酸菌偏好优化密码子,将合成的截短的聚-γ-谷氨酸合成酶A(PgsA′)和截短的沙门氏菌鞭毛融合基因(Salmonella FliC)克隆到载体pUC57中,通过PCR和双酶切鉴定正确性;通过双酶切和T4连接插入目的基因到乳酸乳球菌表达载体pNZ8048中,构建重组质粒pNZ8048-PgsA′-FliC,通过PCR和双酶切鉴定正确性;提取质粒后将重组质粒利用电穿孔法转入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)NZ9000中,挑取阳性克隆,扩增培养后提取质粒,通过PCR和双酶切鉴定正确性;通过Western-blot检测外源基因在重组菌中的表达情况;对Balb/c小鼠口服免疫重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-PgsA′-FliC,以NZ9000/pNZ8048和PBS为对照,通过ELISA测定小肠黏液中特异性sIgA抗体表达水平。结果表明:成功构建了重组质粒pNZ8048-PgsA′-FliC与重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-PgsA′-FliC,并成功表达PgsA′-Fli...     

饲喂乳杆菌雏鸡对鸡白痢菌感染的影响

雏鸡饲喂乳杆菌培养物后,人工感染鸡白痢沙门氏菌,观察雏鸡盲肠主要正常菌群定植及雏鸡抵抗力情况。研究结果表明：人工感染鸡白痢沙门氏菌后,饲喂乳杆菌组同未饲喂乳杆菌组相比,雏鸡盲肠内正常菌群有一定变化,大肠杆菌数明显降低（Ｐ＜００１）,双歧杆菌和乳杆菌数明显增加（Ｐ＜００１）,而且死亡率降低２０％。     

雏鸡脑炎型鸡白痢沙门氏菌感染的诊断与防治

某黄鸡养殖农户4条大棚雏鸡总存栏量40 000只左右,在12日龄免疫后发病。临床症状表现为出现有神经症状的"扭头鸡",采食量下降,病鸡在跑动后有后蹲的姿势。第一条棚雏鸡先发病,随后3条棚雏鸡相继发病,病症相似。病程持续近10天,总死亡量约1 000只。根据发病背景、症状观察、病理变化、细菌分离及PCR试验、生化试验和血清型鉴定等一系列工作,诊断为由鸡白痢沙门氏菌引起的细菌性疾病。同时进行了病原菌的动物回归试验,在雏鸡体内成功复制出该临床疾病。根据药敏试验结果对发病鸡群进行治疗,使病情得到迅速的控制。     

鸡沙门氏菌和雏鸡白痢沙门氏菌毒力质粒的研究进展

鸡沙门氏菌和雏鸡白痢沙门氏菌毒力质粒的研究进展高崧综述刘秀梵审校（杨州大学农学院畜牧兽医系）毒力质粒（Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｐｌａｓｍｄｉ，ＶＰ），又称毒力相关质粒（Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｌａｓｍｉｄ）。自Ｊｏｎｅｓ等于１９８２年在鼠...     

鸡白痢沙门氏菌引起的雏鸡脑脊髓炎

我们多次从具有神经症状的白痢雏鸡脑组织中分离出鸡白痢沙门氏菌,病雏的临床症状和病理组织学变化呈现典型的脑脊髓炎特征。证实鸡白痢沙门氏菌是引起雏鸡脑脊髓炎的病原体。现将研究结果简介如下。     

表达鸡IL-12重组乳酸乳球菌的构建及其生物学活性检测

鸡白细胞介素12(ChIL-12)是由IL-12p40和IL-12p35两个亚基组成的一个异源二聚体,具有促进T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK cell)成熟的作用,能够作为黏膜疫苗佐剂。本研究中采用公认的食品级乳酸乳球菌表达系统构建表达目的融合蛋白Ch IL-12p40-(G_4S)_3ChIL-12p35(rChIL-12),并经western blot检测。结果显示:目的融合蛋白呈可溶性状态表达。体外鸡淋巴细胞刺激试验显示,经rChIL-12处理的鸡脾淋巴细胞能够产生干扰素γ(IFN-γ),表明该融合蛋白具有诱导IFN-γ产生的生物学活性。本研究结果为进一步利用rChIL-12作为粘膜疫苗佐剂的研发奠定了基础。     

口服表达胸腺肽和鸡干扰素融合蛋白的重组乳酸乳球菌对鸡肠道菌群影响的研究

为构建表达胸腺肽和鸡γ干扰素融合蛋白(Tα1-cIFN-γ)的重组乳酸乳球菌并检测其作为口服免疫增强剂对鸡外周血单个核细胞(PBMC)的增殖活性及鸡肠道菌群的影响,本研究将鸡胸腺肽(Tα1)和鸡干扰素(cIFN-γ)的编码基因序列(去除干扰素信号肽编码基因序列),并按照宿主菌乳酸乳球菌NZ3900株的基因组优化密码子后,以经G4S-linker连接的Tα1-cIFN-γ基因为模板,采用PCR扩增携带表达载体p NZ8149同源臂及HA标签的目的基因序列(Tα1-cIFN-γ-HA);通过PCR扩增携带Tα1-cIFN-γ-HA基因序列同源臂的全长p NZ8149载体序列,利用同源重组的方式将这两段基因连接构建重组质粒p NZ8149-Tα1-cIFN-γ-HA,并经PCR和测序鉴定正确后电转化乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中,构建重组乳酸乳球菌p NZ8149-Tα1-cIFN-γ-HA/NZ3900 (r L.lactis-Tα1-cIFN-γ)并经PCR和测序鉴定;将重组乳酸乳球菌r L.lactis-Tα1-cIFN-γ经乳酸链球菌素(Nisin)诱导6 h～7 h,离心超声破...     

鸡白痢沙门氏菌感染情况的调查

鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的一种败血性细菌性疾病 ,它能垂直传递和水平传播。为了控制本病 ,对种鸡群进行净化是最根本的措施。鸡白痢净化的主要方法是检测淘汰阳性种鸡和防止再次感染。检测方法主要是采用现场全血平板凝集试验。为了最大限度检出和淘汰阳性鸡 ,连续进行了 4次检测。1　材料和方法鸡白痢平板凝集抗原 :由中国兽药检察所生产的鸡白痢鸡伤寒多价染色抗原。鸡白痢阳性和阴性对照血清 :由中国兽药检察所提供。检测方法和判断标准 :全血平板凝集试验。检测时机 :1 6周龄开始 ,全群普检 ,淘汰阳性鸡 ,如阳性率大于 0 .2 % ,…     

泻痢安糖糊对人工感染雏鸡鸡白痢沙门氏菌的治疗实验

以鸡白痢沙门氏菌为菌种,对２～３日龄雏鸡进行了人工感染致病的分组药物治疗比较试验。取２１０只雏鸡随机分成７组,除阴性对照组外,每组都接种鸡白痢沙门氏菌,每只鸡的接种量按最小致死量给予。阳性对照组不给药治疗,其中５组分别用泻痢安糖糊高剂量、中剂量、低剂量、中药鸡痢灵和西药可溶性氟哌酸给予治疗,连续用药４ｄ,停药观察７ｄ。结果表明,泻痢安中剂量组的存活率达９０％,即泻痢安中剂量对雏鸡鸡白痢的治疗效果可列各组之首。     

鸡白痢沙门氏菌的净化效果监测

正沙门氏菌病是一种多种动物共患的传染病,其病原是沙门氏杆菌。根据病原特点,它可以分为三种不同的疾病,即禽伤寒、地方流行性禽副伤寒和鸡白痢。近年来,鸡白痢沙门氏菌流行广泛,给养禽业造成了严重的影响和较大的经济损失。为了解新疆维吾尔自治区规模化肉种鸡场鸡白痢沙门氏菌的感染情况,分6批从4栋鸡舍采集血清2400份,进行鸡白痢沙门氏菌抗体检测,并对鸡场采取了净化措施。     

表达鸡白痢沙门氏菌OmpC基因重组枯草芽孢杆菌的构建

<正>鸡白痢(pullorum disease)是由鸡白痢沙门氏菌引起雏鸡和火鸡的传染性疾病,临床上以急性化脓性和出血性败血症为特征,或呈慢性或隐性经过。鸡沙门氏菌病传播速度快,雏鸡病死率高,成年鸡的生产性能下降,种蛋的孵化率降低,给养鸡业带来严重危害。另外,鸡白痢沙门氏菌能够在家禽肠道内定植,在加工家禽胴体时,污染鸡肉继而进入人类食物链,成为人类沙门氏菌感染的潜在来源,对人类的健康存     

表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其表达的优化

鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2蛋白是该病毒的主要抗原蛋白,为制备乳酸菌黏膜免疫口服疫苗,本研究采用乳酸乳球菌(L.lactis)及其Nisin诱导的表达系统,对VP2基因进行密码子优化,构建了表达IBDVVP2蛋白的重组乳酸乳球菌L.lactis/p NZ-VP2。经正交试验对诱导条件进行优化,重组VP2蛋白(r VP2)表达量比优化前明显提高,最终得到最佳诱导条件为:OD600nm=0.5开始诱导,Nisin终浓度为2 ng/m L,诱导时间为5 h,r VP2表达量达到最大值38μg/m L。经western blot检测,r VP2能够持续性表达并具有良好的抗原性。该重组乳酸菌的构建为进一步体内免疫实验奠定了基础。