牛支原体及其脂质相关膜蛋白诱导胎牛肺细胞IL-1β表达的分子机制研究

为研究牛支原体(M.bovis)及其脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导胎牛肺(EBL)细胞IL-1β表达的分子机制,本研究首先以M.bovis及其LAMPs刺激EBL细胞,利用荧光定量PCR检测细胞因子IL-1β的动态变化;然后将融合表达的细胞p65(Rel A)蛋白和绿色荧光蛋白重组质粒p EGFP-p65转染EBL细胞,以LAMPs刺激EBL细胞,通过激光共聚焦观察p65的亚细胞分布。荧光定量PCR结果显示,M.bovis及其LAMPs能够诱导EBL细胞IL-1β的表达;而且LAMPs作用的最佳剂量为2μg/m L,最佳时间为12 h。同时,激光共聚焦试验检测到LAMPs能够诱导p65进入EBL细胞核中。上述实验结果表明LAMPs能够诱导EBL细胞中p65进入细胞核内,从而激活NF-κB信号通路,诱导IL-1β上调表达。     

TRIM9基因调控牛支原体脂质相关膜蛋白诱导EBL细胞IL-1β表达的研究

为探究宿主TRIM9基因通过调控牛支原体(Mycoplasma bovis,M. bovis)脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导胎牛肺(EBL)细胞释放致炎细胞因子IL-1β的相关机制,本研究通过M. bovis LAMPs刺激EBL细胞后,利用荧光定量PCR(qPCR)方法检测细胞中TRIM9和IL-1β基因的转录水平,结果显示TRIM9基因转录水平上调2.9倍,IL-1β基因转录水平上调2.5倍。构建pEGFP-C1-TRIM9荧光报告质粒并转染EBL细胞,利用共聚焦显微镜观察TRIM9在EBL细胞中的定位,结果显示TRIM9蛋白能够瞬时表达于EBL细胞浆。通过将构建的pCMV-C-HA-TRIM9重组质粒和si-TRIM9干扰质粒共转染EBL细胞,经2μg/mL M. bovis LAMPs刺激12 h后,采用qPCR和ELISA检测IL-1β的转录水平和表达情况,结果显示,与M. bovis LAMPs刺激正常EBL细胞组相比,过表达TRIM9组中IL-1β在转录水平和蛋白表达水平均无明显变化,而敲低TRIM9组中IL-1β转录水平和蛋白表达水平均显著上调(分别上调33倍和30倍)。同时利用western blot检测p65蛋白磷酸化水平,分析NF-κB信号通路激活情况,结果显示,与M. bovis LAMPs刺激正常EBL细胞组相比,TRIM9蛋白过表达组NF-κB信号通路激活水平无明显变化,而敲低TRIM9组p65磷酸化水平提高,促进NF-κB信号通路激活。综上结果表明敲低TRIM9基因能够促进M. bovis LAMPs通过NF-κB信号通路诱导EBL细胞释放IL-1β。本研究为进一步明确宿主蛋白参与抗牛支原体天然免疫应答的机制奠定基础。     

TLR2介导鸡毒支原体脂质相关膜蛋白诱导DF-1细胞表达IL-1β的研究

Toll样受体2(TLR2)在鸡毒支原体(MG)诱导天然免疫反应机制中的作用尚未明确。为鉴定TLR2在MG脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导细胞表达IL-1β中的作用,本研究通过RT-PCR和ELISA方法检测LAMPs刺激后DF-1细胞中IL-1β的m RNA和蛋白水平,结果显示LAMPs可以诱导DF-1细胞分泌IL-1β,并确定最佳刺激时间为6 h,最佳刺激剂量为1μg/m L。此外,通过构建TLR2重组表达质粒p CMV-HA-TLR2,并将该质粒转染DF-1细胞进行过表达及通过抗体封闭TLR2的两种处理方式,处理后采用LAMPs刺激细胞。经检测显示:TLR2过表达处理组的IL-1βm RNA和蛋白水平显著升高,而抗体处理组的IL-1βm RNA和蛋白水平下调。结果表明,LAMPs能够与DF-1细胞膜上的TLR2受体结合,有效的诱导DF-1细胞表达并分泌IL-1β,而且IL-1β的释放可能与天然免疫系统的经典通路即NF-κB信号通路调控有关。本研究为阐述MG的致病机制提供相关实验依据。     

牛结节性皮肤病病毒感染MDBK细胞后转录组差异表达分析

旨在探索牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)与宿主细胞的相互作用,采集了具有典型临床症状的牛皮肤病变组织,接种MDBK细胞进行病毒分离,采用透射电镜观察病变组织及病毒感染后的MDBK细胞,同时对感染后24 h的MDBK细胞进行转录组学分析,筛选差异表达基因并将其按功能分类,分...     

牛支原体膜蛋白的研究进展

正支原体(Mycoplasma)是目前世界上最小的、进行自我复制的、且能在无生命培养基中生长的原核生物,结构简单,缺乏细胞壁,能通过0.22微米的细菌滤器。支原体种类繁多,对人类和动植物造成的危害大,且易污染体外培养的细胞,给科研工作带来     

绵羊肺炎支原体及其脂质相关膜蛋白诱导绵羊肺泡巨噬细胞IL-1β表达的分子机制

为证明TLR2是否参与绵羊肺炎支原体(Mo)或LAMPs刺激肺泡巨噬细胞时细胞因子的表达,使用Mo或LAMPs刺激绵羊肺泡巨噬细胞后,利用荧光定量PCR、流式细胞术、Western blot以及ELISA等方法分别对TLR2转录和翻译水平、MAPK信号通路激活情况和IL-1β分泌情况进行检测。同时,使用TLR2抑制抗体及MAPK抑制剂后,利用荧光定量PCR、Western blot以及ELISA检测MAPK信号通路激活情况和IL-1β分泌情况。结果显示,绵羊肺泡巨噬细胞受Mo或LAMPs刺激后,TLR2在基因和蛋白表达水平均有不同程度上升,MAPK信号通路中各信号蛋白均发生磷酸化反应,IL-1β在基因和蛋白表达水平均有不同程度上升。对TLR2及MAPK功能抑制后,MAPK信号通路的激活及IL-1β的表达均受到明显抑制。结果提示,Mo及其LAMPs可通过绵羊肺泡巨噬细胞的TLR2受体激活MAPK信号通路,继而引起细胞因子IL-1β的分泌增多。     

基于转录组测序的油酸诱导延边牛骨骼肌卫星细胞成脂分化差异表达基因的分析

本研究旨在研究油酸(OA)引起延边牛骨骼肌卫星细胞成脂分化途径的分子调控机制.对从12日 龄延边牛中分离得到的骨骼肌卫星细胞进行体外培养,加入不同浓度OA的诱导分化培养液,进行分化处理,试验设1个空白对照组[CON组,5％马血清(HS)],3个不同浓度OA 诱导组:OAL 组(5％HS+50 μmol/L OA)、OA...     

牛支原体脂质相关膜蛋白P48、DnaK和L-LDH免疫反应原性的鉴定及分析

为筛选并鉴定免疫反应原性良好的牛支原体(M.bovis)蛋白,本研究提取M.bovis TJ株脂质相关膜蛋白(LAMPs),通过AKTA分子筛筛选,将M.bovis LAMPs分为5组,经dot blot试验鉴定各组LAMPs的免疫反应原性,并经蛋白质谱分析其蛋白组分.结果显示,5组LAMPs中有1组膜蛋白反应原性较好...     

LPS诱导牛子宫内膜细胞miRNA差异表达分析

MicroRNA(miRNA)在炎症反应中起重要作用,本试验用miRNA测序技术研究了细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的牛子宫内膜细胞miRNA差异表达。用1μg/mL的LPS处理牛子宫内膜细胞24 h,测定细胞上清液IL-6和IL-8分泌量,对细胞进行miRNA测序,并用荧光定量PCR验证测序结果。结果表明,LPS可诱导牛子宫内膜细胞11个miRNA表达上调、9个miRNA表达下调。差异表达miRNA的靶基因注释到生物过程的GO term共20个,注释到细胞组分的GO term共12个,注释到分子功能的GO term共20个;差异表达miRNA靶基因主要富集于PI3K-Akt和MAPK等信号通路。结果提示,miRNA在LPS诱导的牛子宫内膜细胞炎症反应中起重要作用,其作用与PI3K-Akt和MAPK等信号通路激活有关。     

牛支原体P48膜蛋白的原核表达及生物信息学分析

对牛支原体(M.bovis)主要免疫蛋白P48蛋白的保守性和蛋白结构与功能进行分析,为进一步对P48蛋白的免疫特性和致病机制研究奠定基础。本研究通过获取M.bovis Ningxia-1菌株P48蛋白基因序列,构建pET28a-P48质粒并导入大肠杆菌BL21感受态细胞进行原核表达,并通过Ni柱进行重组蛋白纯化、SDS-PAGE电泳和免疫小鼠试验进行验证;利用生物信息学工具分析P48蛋白核酸序列的保守性和蛋白序列的理化性质、二级结构、疏水区、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、抗原表位、三级结构及不同碱基的突变对该蛋白功能的影响。结果表明,通过大肠杆菌原核表达系统可以成功表达重组P48蛋白,并且该蛋白可以激发小鼠产生较高水平的抗体;P48蛋白核酸序列保守,在不同M.bovis菌株中碱基序列无差异;P48蛋白相对分子质量为51 159.08,含有468个氨基酸,其中强酸性氨基酸57个,强碱性氨基酸63个,极性氨基酸116个,疏水氨基酸169个,等电点为8.776;1～24位为P48蛋白的信号肽,具有较强的疏水性,并且为跨膜螺旋区;二级结构包含alpha helix、beta sheet、beta turn、random coil 4种形式;抗原表位有13个区域;P48蛋白位于细胞内膜上,是膜脂蛋白家族中ABC转运体的溶质结合蛋白2;该蛋白存在多个突变敏感区域,该区域的改变可能直接影响P48蛋白的功能。本研究的开展为M.bovis P48蛋白的免疫特性和致病机制研究奠定了基础,为M.bovis抗体检测试剂的研制和M.bovis病原的诊断提供了科学的依据。     

牛卵泡ODF1与ODF2转录组发育相关基因筛选及表达差异分析

旨在从牛发情周期第一卵泡波中最大卵泡ODF1(The largest follicle at onset of deviation)和第二大卵泡ODF2(The second largest follicle at onset of deviation)转录组水平上筛选卵泡发育差异表达基因。采集牛发情周期第一卵泡波ODF1和ODF2,分别分离颗粒细胞并提取总RNA,构建RNA文库,通过Illumina平台对ODF1和ODF2测序;筛选出ODF1与ODF2两个转录本之间比值大于2的差异表达基因,并采用qRT-PCR对筛选出的基因在牛发情周期内第一卵泡波优势卵泡(Dominant follicles,DF)和从属卵泡(Subordinate follicles,SF)颗粒细胞中功能验证。共获得8个卵泡发育差异表达基因,其中7个基因筛选自ODF1/ODF2(BEX2、UBN1、SIK1、SPARCL1、LOC784256、LOC789231和LOC785462),1个筛选自ODF2/ODF1(SAFB2);qRT-PCR结果表明,BEX2、UBN1、LOC784256和LOC789231在DF中mRNA表达量极显著高于SF(P0.01),SAFB2在SF中mRNA表达量极显著高于DF(P0.01),SIK1和SPARCL1在SF中mRNA表达量显著高于DF(P0.05),虽然LOC785462在SF中mRNA表达量高于DF,但差异不显著(P0.05)。qRT-PCR检测BEX2、UBN1、LOC784256、LOC789231和SAFB2的结果与高通量测序中该基因在ODF1和ODF2的RPKM的差异趋势基本一致,而SIK1、SPARCL1和LOC785462不一致。     

藏鸡与白羽肉鸡垂体转录组差异表达研究

试验旨在通过对藏鸡和白羽肉鸡垂体转录组测序和生物信息学分析,筛选出与鸡生长发育相关的差异表达基因（differentially expression genes,DEGs）及信号通路。本研究选用42日龄健康藏鸡和白羽肉鸡各3只,分别采集垂体组织利用Illumina HiSeq 2000平台进行转录组mRNA测序,对筛选到的DEGs筛选DEGs,GO和KEGG数据库功能注释和富集分析,实时荧光定量PCR验证随机挑选的DEGs表达水平。结果显示,藏鸡和白羽肉鸡分别获得126 094 302和125 666 442条clean reads。与白羽肉鸡相比,藏鸡垂体组织中共有DEGs 392个,其中196个为上调基因,196个为下调基因（P<0.05）,其中包括生长激素（GH）基因、生长激素释放激素受体（GHRHR）基因和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（IGF2BP1）基因。GO和KEGG富集分析发现,DEGs显著富集于细胞黏附分子信号通路和神经活性配体-受体相互作用信号通路等细胞通讯相关的信号通路,GH、GHRHR和IGF2BP1基因也显著富集于神经活性配体-受体相互作用信号通路。实时荧光定量PCR结果显示,转录组测序结果准确可靠。综上研究,本研究初步揭示了影响藏鸡和白羽肉鸡生长发育速度差异的关键候选基因和信号通路,为了解鸡垂体组织调节生长发育的分子机制提供了理论依据。     

牛支原体生物学特性及其膜蛋白的研究进展

牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)是引起牛肺炎、关节炎、乳房炎和中耳炎等众多疾病的主要病原之一,牛支原体引起的疾病在欧美地区广泛蔓延并造成巨大的经济损失。中国2008年首次报道在犊牛肺炎中分离到牛支原体,目前国内对牛支原体的认识还很欠缺,现对牛支原体生物学特性及其膜蛋白进行简要综述,以期为牛支原体病的防控与治疗提供一定的参考依据。     

牛支原体膜蛋白6种提取方法的比较研究

为筛选最佳牛支原体(mycoplasma bovis,Mb)膜蛋白的提取工艺,本试验以牛支原体W70株为代表,分别比较了4种浓度的TritonX-100 、TritonX-114、TritonX-100和TritonX-114;3种浓度碘化钾(KI)复合提取;反复冻融和超声裂解等6种Mb膜蛋白提取工艺和参数.各方法所获膜蛋白经SDS-PAGE和Bradford定量分析表明:不同方法的提取物中蛋白多肽和蛋白浓度各异;其中以3％ TritonX-114和0.4％TritonX-100结合0.6 MKI两法提取的蛋白条带清晰度较好,蛋白浓度及蛋白收集率较高,蛋白多肽条数24～28条,蛋白相对分子质量分别在170 000～12 200和167 000～11 400之间;超声裂解及反复冻融法提取效果一般;而1.8 MKI法效果最差.研究发现3％TritonX-114或0.4 ％TritonX-100结合0.6 MKI是Mb膜蛋白较优的提取方法.     

绵羊肺炎支原体及其脂质相关膜蛋白通过Toll样受体2激活MAPK信号通路诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α表达的研究

为验证绵羊肺炎支原体(M.ovi)或脂质相关膜蛋白(LAMPs)是否通过Toll样受体2(TLR2)诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的表达,本研究利用不同浓度的M.ovi或LAMPs刺激C57BL/6J WT小鼠及Tlr2-/-基因缺失小鼠的腹腔巨噬细胞12h后,利用荧光定量PCR(qPCR)检测Tlr2和TNF-α基因...     

牛干扰素诱导跨膜蛋白基因的克隆、序列分析及表达

参照GenBank中牛干扰素诱导跨膜蛋白(bIFITMs)编码序列设计上、下游引物,通过RT-PCR技术扩增目的序列。将扩增产物连接至pMD18-T载体上,测序,使用DNAStar、DNA MAN、MEGA6.0等生物信息学软件对其进行核苷酸、氨基酸序列同源性分析以及关键位点氨基酸比对,并完成进化树的绘制。同时,将测序正确的目的序列进一步亚克隆至真核表达载体pLV-EGFP,转染HEK293T、BHK-21细胞,通过RT-PCR,蛋白免疫印迹(Western blot)验证外源基因在细胞内的表达情况。结果表明,获得bIFITMs编码序列,完成其相关生物信息学分析,同时,成功构建含有bIFITMs编码序列的重组真核表达质粒pLV-bIFITM1、pLV-bIFITM2、pLV-bIFITM3,且在HEK293T、BHK-21细胞中有效表达,为进一步探讨bIFITMs的抗病毒作用以及动物转基因抗病毒育种提供了试验基础。     

四氯化碳诱导慢性肝损伤模型小鼠的转录组学分析

为了研究小鼠慢性肝损伤发病过程中肝脏组织转录组学变化规律,试验将40只ICR小鼠随机均分为肝纤维化正常对照组(A-C组)、肝纤维化模型组(A-M组)、肝硬化正常对照组(B-C组)和肝硬化模型组(B-M组),其中A-M组和B-M组分别用四氯化碳(CCl₄)+橄榄油溶液连续灌胃7周和11周,A-C组和B-C组分别连续灌胃等量的橄榄油7周和11周,试验结束后采集小鼠血液,测定天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性,并取肝脏组织进行转录组测序,对转录组学分析存在显著差异的基因通过实时荧光定量PCR方法进行验证。结果表明：与A-C组小鼠相比,A-M组AST与ALT活性显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),从肝脏组织中共检测到了1 109个差异基因,其中有956个上调基因,153个下调基因;与B-C组小鼠相比,B-M组AST与ALT活性均极显著升高(P<0.01),从肝脏组织中检测到509个差异基因,其中397个上调基因,112个下调基因;与B-M组相比,A-M组肝脏组织中检测到70个差异基因,其中有41个基因上调和29个基因...     

胎牛视网膜干细胞向神经细胞诱导研究

旨在研究胎牛视网膜干细胞(Retinal stem cells,RSCs)的分离、培养、鉴定及向不同类型细胞诱导分化等的生物学特性。采用机械吹打法从胎牛眼睫状体部细胞中分离RSCs,通过免疫荧光方法鉴定RSCs标志物Nestin、Pax-6和Chx-10,并诱导其向星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞诱导分化,检测其多向分化潜能。结果表明,机械吹打法获得的胎牛RSCs不仅表达干细胞特有的标志,而且成功诱导分化为星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞。综上表明,胎牛RSCs具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能。为今后视网膜干细胞的研究提供相应的理论依据。     

蒙古马高负荷运动训练前后转录组差异表达分析

旨在对蒙古马高负荷运动训练前后转录组差异表达进行分析。本试验对6匹进行了4个月高负荷运动训练的蒙古马进行研究,分别在训练前后两个时期采集肌肉样品,利用二代测序技术对肌肉样品建立转录组文库,对发生显著变化的差异基因进行GO功能富集和KEGG Pathway分析,寻找训练前后发生显著变化的代谢通路及相关候选基因。结果表明,在转录组筛选到的1 102个显著差异表达基因中,有299个在训练后发生下调,803个发生上调。这些差异基因被注释到3 398条GO term上。其中与运动学相关的生物学过程有:肌肉结构发育、心血管系统发育、循环系统发育、肌肉组织发育、肌肉器官发育、肌肉收缩和肌肉细胞分化等。对差异表达基因进行KEGG pathway分析,结果表明,差异基因被富集到如扩张型心肌病、肥厚型心肌病、心肌收缩、钙信号通路、肌动蛋白骨架调节等与运动相关的193条通路中。本研究结果为探究蒙古马强耐力的基本分子机理提供理论基础,同时也为理解蒙古马运动学特性提供新的思路。     

脂质代谢组学的研究进展

脂质是动物体内重要的生物大分子之一,具有多种重要生物学功能。脂质代谢组学是新兴起的一门研究脂质代谢调控在各种生命现象中作用机制的新学科。它通过从系统水平上研究生物体内的脂质,揭示脂质分子及与其他生物分子间的相互作用。脂质代谢组学在营养学、功能基因组学等相关学科中的应用已有许多报道。本文主要介绍了脂质的分类与代谢、脂质代谢组学的概念、研究方法、研究现状及其应用研究进展等。