胸膜肺炎放线杆菌flp基因缺失菌株的构建及生物学特性

flp(fimbrial low-molecular-weight protein)操纵子由13¹5个基因组成,在细菌中广泛存在,主要编码一种类菌毛(Flp菌毛)的束状纤维蛋白,与细菌在宿主中的黏附和定植有关。本试验利用同源重组技术获得了无抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清Ⅰ型4074菌株的flp基因缺失菌株,通过对基因缺失菌株进行一系列的生物学特性研究,探索胸膜肺炎放线杆菌的flp基因功能。结果表明,flp基因的缺失不会对胸膜肺炎放线杆菌在体外的生长和其溶血活性产生明显影响,但能导致猪胸膜肺炎放线杆菌4074菌株丧失形成菌毛的能力;以小鼠为模型的动物试验结果显示,基因缺失菌株的致病力较亲本菌株有所降低。     

胸膜肺炎放线杆菌MnmE基因突变株的构建及其生物学特性的研究

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm E通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选Mnm E基因缺失株(S8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-Mnm E电转化至S8△Mnm E感受态细胞中,经卡那抗性筛选Mnm E全长基因回补株(cS8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定。将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性。采用q RT-PCR检测Mnm E基因突变对其上下游基因转录水平的影响。结果显示,突变株S8△Mnm E和回补株cS8△Mnm E均正确构建,且遗传稳定性均较好;q RT-PCR结果显示,S8△Mnm E株Mnm E上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异。通过检测不同时间点的OD600nm值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长...     

胸膜肺炎放线杆菌生物学特性概述

胸膜肺炎放线杆菌 (Actinobacilluspleuropneumoniae ,Ap)早称为副溶血嗜血杆菌 (H .Parahaemolytious) ,现归属于放线杆菌属中 ,命名为胸膜肺炎放线杆菌 (A .pleuvropneumoniae)。放线杆菌属引起动物发病主要种有胸膜肺炎放线杆菌 (A .pleuropneumoniae) ,林氏放线杆菌 (A .lignieresii)、猪放线杆菌 (A .suis)、驹放线杆菌 (A .equili)、人放线杆菌 (A .hominis)等几种菌。胸膜肺炎放线杆菌包括两个生物型 ,生物Ⅰ型即依赖V因子 (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD辅酶Ⅰ)生长的原胸膜肺炎嗜血杆菌 ;生物Ⅱ型即也能引起猪坏死性胸膜肺炎的低…     

胸膜肺炎放线杆菌apxIIC-/kanr 基因缺失减毒株的构建

重组转移载体pBSKA通过电转化导入亲本菌胸膜肺炎放线杆菌血清7型（APP-7）WF83株,电转化后的产物涂布于TSB／Kan平板,2d获得突变株。卡那霉素抗性实验证实突变株有卡那霉素抗性;NAD依赖性实验证实突变株依赖NAD生长;PCR鉴定证实了卡那霉素抗性基因置换了apxlIC基因,并证实突变株中无pBSKA质粒的存在;溶血活性实验证实突变株完全失去了溶血活性;细胞毒性实验证实突变株的细胞毒性完全丧失;对小鼠的安全性实验证实突变株的毒力显著减弱,突变株对小鼠是安全的;遗传稳定性实验证实,突变株在体外连续传30代和在体内传10代均不会发生卡那霉素抗性的丢失。结果表明实验成功构建了基因缺失减毒株,为进一步以此突变株作为基因工程弱毒活疫苗株开展研究奠定了一定的基础。     

胸膜肺炎放线杆菌血清7型apxIV基因缺失突变株的构建和鉴定

ApxIV是胸膜肺炎放线杆菌的一种RTX毒素,为探究其在胸膜肺炎放线杆菌致病过程中的作用,以血清7型APP HB04为亲本菌株,通过接合转移和负向筛选方法,构建了一株apxIV基因缺失突变株。通过PCR、序列分析、Southern blot分析及遗传稳定性分析等证明成功构建了突变株。对突变株生物学特性进行初步研究,发现突变株与亲本菌株相比,体外生长速度未发生明显变化,对小鼠的致病力有所降低。结果表明,毒素ApxⅣ在胸膜肺炎放线杆菌致病过程中发挥一定作用。突变株的成功构建及生物学特性研究为进一步阐明胸膜肺炎放线杆菌的致病性及开发更为安全、高效的基因工程疫苗奠定了坚实基础。     

猪放线杆菌胸膜肺炎模型的构建及其评价

采用生物学指标监测猪的疾病状态可为评价各种抗生素的临床疗效提供客观依据。本文通过血清急性相炎症蛋白（C反应蛋白,CRP;血清淀粉样蛋白,SAA）和前致炎细胞因子（IL-6,TNF-α和IFN-γ）含量的检测,结合疾病诊断中传统的临床评价指标（临床症状、X光检查、病理学检查）,对构建的猪放线杆菌胸膜肺炎模型进行了评价。试验猪随机分为3组：两感染组通过气管内注射血清2型胸膜肺炎放线杆菌构建肺炎模型,另一组接种无菌生理盐水作为阴性对照。一个感染组在接种16小时后经口一次性给予替米考星粉（20mg／kg）。接种后．猪血清CRP,SAA和IL-6的水平随着疾病发生逐渐升高,而血清TNF-α和IFN-γ水平则无显著变化。给予替米考星后有效降低了血清CRP和SAA的水平和持续时间。因此,血清CRP,SAA和IL-6的水平可以有效地评价猪放线杆菌胸膜肺炎模型。此外,CRP和SAA可以作为评价抗生素治疗的有效生物学指标。     

胸膜肺炎放线杆菌研究进展

胸膜肺炎放线杆菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae,APP,也有简写为 Ap) ,原称胸膜肺炎嗜血杆菌(H aemophiluspleuropneumoniae,Hp) ,属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属 ,后又根据其表型 (phenotype)和 DNA杂交水平均与放线杆菌属模式种密切相关 ,归属为巴氏杆菌科放线杆菌属 ,命名为猪胸膜肺炎放线杆菌 [1 ] 。由本菌引起的猪接触传染性胸膜肺炎是猪的呼吸道传染病 ,各种年龄的猪均易感染 ;常与巴氏杆菌等混合感染 [1 ]。病猪发热 (可达 4 2℃ ) ,呼吸困难 ,食欲不振 ;剖检可见纤维素性胸膜肺炎 ,多感染两侧 ,6 5 %的肺叶病变严重 ;发病率 8.…     

副猪嗜血杆菌potD基因缺失株的构建及其部分生物学特性

potD基因编码的蛋白质作为转运体蛋白,负责多胺的结合和转运,为细胞的正常生长提供必需因子,已在多种病原菌中鉴定为毒力相关因子,但在副猪嗜血杆菌中的作用还不清楚。利用自然转化法构建potD缺失株SC1401ΔpotD::kan,再比较亲本株和缺失株的生长特性、自凝集活性、生物被膜形成能力、抗血清杀菌能力以及对小鼠的致病力。结果显示potD基因的缺失不影响副猪嗜血杆菌的生长、自凝集活性和生物被膜形成能力,但导致该菌的抗血清杀菌能力和对小鼠的致病力显著降低。以上结果表明potD基因可能与副猪嗜血杆菌的毒力相关。     

副猪嗜血杆菌lgtF基因缺失株的构建及其部分生物学特性

lgtF基因编码的葡萄糖基转移酶在脂寡糖(LOS)的合成过程中负责增加一个葡萄糖合成庚糖I,在部分革兰阴性菌中是重要的毒力相关基因,但lgtF基因在副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)中的作用还不清楚。本研究利用遗传操作方法构建HPS SC096的lgtF基因缺失株(ΔlgtF)。通过热酚法分别提取缺失株与野生株的LOS,将提取的LOS进行SDS-PAGE和银染。比较缺失株与野生株的生长曲线、抗血清中补体杀菌能力以及对宿主细胞——猪血管内皮细胞(PUVEC)和猪肾上皮细胞(PK-15)的黏附和入侵能力。结果表明与野生株相比,ΔlgtF的LOS糖链结构变短,生长速度稍微减慢,另外,ΔlgtF在兔和猪血清中抗补体杀菌能力明显降低(P0.05),对PUVEC和PK-15细胞的黏附入侵能力明显降低(P0.05)。以上结果表明lgtF基因是HPS的一个毒力相关基因。     

肠炎沙门氏菌tu-fA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat~r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat~r-FRT-tu-fA3'),将该DNA片段电转化于含有质粒pKD46的S.enterica SM6株中进行同源重组,通过氯霉素抗性筛选tu-fA基因缺失的SM6株(SM6△tu-f A::cat),再通过导入质粒pCP20于SM6△tu-fA::cat中敲除cat r基因,从而构建了tu-fA基因缺失株SM6△tu-fA。生物学特性鉴定结果表明,基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与亲本株相比,细菌形态未发生明显改变,但基因缺失株体外生长速率略低,利用碳源的能力有所增强;缺失株侵袭Caco-2细胞的能力与亲本株相比有所降低,表明tu-f A基因编码的延伸因子(EF-Tu)在调控细菌侵袭细胞的过程中起着一定的作用。本研究通过构建tu-fA基因缺失的S.enterica株,为进一步研究tu-fA基因编码的EF-Tu的功能奠定基础。     

一株四川株猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

猪传染性胸膜肺炎的病原为猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App),该菌为革兰阴性,有荚膜、菌毛和鞭毛,形态较小,呈多形性.近年来,全国很多省份都有猪传染性胸膜肺炎的发病报道.随着临床混合感染和细菌耐药性的增加,迫切需要对细菌进行分离鉴定,最终找到控制或消灭该病的方法.     

胸膜肺炎放线杆菌菌毛研究进展

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleurop—neumoniae，APP）是引起猪传染性胸膜肺炎的致病菌，能够引起各个年龄阶段的猪发生急性或慢性感染。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxIICA基因的克隆和基因缺失

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25＿4株ApxIICA基因用特异性引物进行PCR扩增并克隆到T载体上,构建重组质粒pMD18＿ApxIICA,将pMD18＿ApxIICA转化到E.coliJM83中并测序。序列分析表明血清型7型25＿4株ApxIICA与其它血清型(5型和9型)核苷酸序列同源性达98%以上,氨基酸序列同源性达90%以上。利用ApxIIC基因内部单一的SpeI位点,设计特异性的引物,利用PCR技术在ApxIIC基因内部缺失165bp的核苷酸片段,PCR产物再用SpeI进行酶切,并体外连接构建得到含有ApxIIC缺失基因的重组质粒pMD18＿ApxII△CA。     

胸膜肺炎放线杆菌adh基因敲除株与5b野生株的培养特性及致病性比较

三聚体自转运黏附素(trimeric autotransporter adhesin,TAA)是近年来发现的参与猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)黏附宿主细胞的重要毒力因子。本研究比较了5b adh基因缺失株(△adh)与5b野生株的生物学特性及其对仔猪的致病性。结果表明,在BHI液体培养基中,△adh生长速度明显高于5b野生株;△adh在液体培养基中细菌集聚性明显减弱;仔猪感染后临床症状典型,猪肺脏病理组织切片结果表明,△adh致病性弱于野生株。本研究结果证实adh在APP黏附宿主过程中发挥重要作用,为下一步探究APP致病机制奠定基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ZY株TfbA基因的克隆及序列分析

对猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumon iae,App)生物I型ZY(App-1)株TfbA基因进行克隆和序列测定,结果表明:ZY株TfbA基因全长1 782 bp,编码594个氨基酸残基组成的多肽;对App ZY株与AP37(App-1)株、AP213(App-5)株和AP205(App-7)株的TfbA基因进行分析比较,结果表明三型TfbA的核苷酸的同源性分别为99.8%、74.4%和72.2%;氨基酸的同源性分别为99.7%、64.1%和58.6%。系统发育进化树分析结果表明,ZY株与AP37株的亲缘关系最近。分析组成TfbA蛋白N-端重叠的16聚体多肽发现了3个有转铁蛋白结合活性的区域,长度为13或14个氨基酸。第1和第3个区域在App-1、App-5、App-7型间变异较大,同源性很低,第2个区域在App-1型和App-5型两者之间同源性高,几乎相同。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离株的分子生物学鉴定

根据已有的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP) dsbE基因序列,合成了一对特异性引物,从3株APP分离菌(BZ1株,BZ2株和BZ3株)均扩增出预期342 bp的DNA片段.分别将扩增的目的基因连接到pMD18-T载体中,构建重组质粒,转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,提取质粒并进行序列分析.结果表明BZ1株dsbE基因与所有14种血清型APP参考株dsbE基因的同源性达98%～100%,BZ2株dsbE基因与所有14种血清型APP参考株dsbE基因的同源性达98%～99%,BZ3株dsbE基因与所有14种血清型APP参考株dsbE基因同源性达97%～98%,证明3株分离菌均为APP.     

耐恩诺沙星胸膜肺炎放线杆菌分离株的分子表征

耐恩诺沙星胸膜肺炎放线杆菌自2002年出现于台湾。目前还没有关于胸膜肺炎放线杆菌耐恩诺沙星机制的报道。从台湾2007年9月-2008年4月之间感染胸膜肺炎放线杆菌的猪肺中获得48株胸膜肺炎放线杆菌分离株。29株分离株对恩诺沙星有抵抗作用。为明确胸膜肺炎放线杆菌耐恩诺沙星的机制,对分离株DNA解旋酶和拓扑异构酶IV以及qnr基因的耐喹诺酮决定区(QRDR)的突变进行了分析,该决定区与分离株对恩诺沙星的敏感性有关。研究发现,耐恩诺沙星的分离株至少在解旋酶A的耐喹诺酮决定区有1个突变,从而导致第83位或第87位密码子编码的氨基酸发生改变。外排泵阻化剂(苯丙氨酸-精氨酸-β-奈胺)使恩诺沙星最小抑菌浓度降低2~16倍,这说明外排物参与了菌株耐恩诺沙星的作用。在这些分离株中未检测到质粒介导的耐喹诺酮基因qnr。总而言之,胸膜肺炎放线杆菌耐恩诺沙星可能与多个靶位基因的突变及外排物的激活相关。     

胸膜肺炎放线杆菌田间分离株的药物敏感性测定

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacollus pleuropneu-moniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎(Porcine conta-gious pleuropneumoniae,PCP)的病原菌,血清型达15种之多,不同血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护作用,加上不同地区流行的主要血清型不统一,使得很难开发出通用的疫苗用于实践,多数猪场仍以药物控制作为预防和治疗本病的主要手段。APP易产生耐药性,要想达到良好的临床控制效果,首要的问题是选择抗菌性能良好的抗菌药物。为此,对自洛阳地区部分规模化猪场分离的APP菌株进行了药物敏感性测定,以便为临床提供指导和帮助。1材料1.1病料无菌采集…