牛精液死精子去除方法在性控冻精生产中的应用

应用Pure Sperm离心法和上游法去除原精中死精子后用流式细胞仪分离精子,比较2种方法的精子优选结果。结果:Pure Sperm离心法处理原精后死精率降低(24.96%vs 13.45%),但解冻后活力(0.38 vs 0.31)和存活时间(4.34 h vs 3.59 h)下降;上游法处理原精后死精率(24.96%vs 17.2%)下降,但差异不显著(P0.05),解冻后活力(0.38 vs 0.40)及解冻后存活时间(4.34 h vs 4.5 h)均无显著差异(P0.05);上游法处理的精液,分离效率与原精相比提升17%,但Pure Sperm法处理后精液分离效率与原精相比没有明显效果;上游法处理后与原精相比顶体完整率(61%vs 61%)、线粒体活性(0.43 vs 0.47)、膜完整性(0.22 vs 0.26)均无显著差异(P0.05)。相比Pure Sperm法,上游法可降低牛原精中的死精率、有效提升精子分离效率并能保持精子活力、顶体完整性和线粒体活性等生理机能,上游法具有潜在应用前景。     

应用微流路精子分离器优选奶牛性控精子的研究

为奶牛性控精子体外受精提供具有活力的精子,筛选出高效的精子分离方法来提高体外受精效率。将市售的冷冻奶牛性控精液解冻、精子浓度调节为1×107cells/m L后,利用微流路精子分离器(microfluidic sperm sorter,MFSS)分离精子,检测分离后的精液质量并分析精子的线粒体膜电位变化。精液样本通过MFSS分离后,精子活力由35.28%提高到57.24%(P0.05);直线速度由23.91μm/s提高到32.76μm/s(P0.05)。此外,MFSS的C室中精子线粒体相对活性为1.56,显著高于分离前A室(0.28)的(P0.05)。综上结果 ,微流路精子分离器可以分离出既有较高活力又具有高活性的线粒体的奶牛性控精子,精子质量得到较大的改善。     

孕酮诱导精子趋化分离的微流控芯片对优选精子质量的影响

基于孕酮可以诱导精子趋化的特性,本实验旨在研究不同长度微流控芯片对精子质量及线粒体活性的影响。通过自行设计制作微流控芯片,将对照组、5 mm孕酮诱导组、7.5 mm孕酮诱导组、10 mm孕酮诱导组对冷冻奶牛精液进行优选,通过自动精子质量分析仪检测精子质量,并采用JC-1染色方法与上浮法比较,通过荧光显微镜检测精子线粒体活性。结果表明:7.5 mm孕酮诱导组的精子活率、直线速度、鞭打频率、前向性测定指标较其他3组显著升高(P0.05);摆动性、线性度、移动角度指标与其他3组差异不显著(P0.05);7.5 mm孕酮诱导组精子畸形率较对照组、5 mm孕酮诱导组显著降低(P0.05);7.5 mm孕酮诱导组分离出的高活性线粒体精子个数与上浮法相比显著升高(P0.05),均衡线粒体活性精子和低活性线粒体精子指标差异不显著(P0.05)。7.5 mm长度的微流路精子分离器分离出的精子无论是在质量参数还是线粒体活性上均达到了最佳效果,具有较高的精子优选能力。     

不同处理方法对牛卵母细胞体外受精效果的影响

在牛体外受精(IVF)过程中,比较不同浓度的牛卵泡液对其卵母细胞的成熟效果,并将成熟的卵母细胞与不同方法获能的精子进行受精,分析其卵丘细胞在受精前后的脱除对卵裂率及囊胚率的影响。结果表明:添加10%的牛卵泡液(BFF)对卵母细胞的成熟有显著的提高作用(P0.05);卵丘细胞在受精后的脱除效果显著优于受精前的脱除(P0.05);上游法和离心法的精子获能方式对IVF没有显著差异,但离心法略优于上游法。     

利用CTC染色进行猪精子不同体外获能方法的比较

为了探讨不同方法对猪精子体外获能的影响,本试验以猪的新鲜精液为研究对象,分别经肝素上游法、钙离子载体诱导法和咖啡因诱导法进行精子不同获能时间的处理,并利用金霉素荧光染色法（chlortetracycline,CTC）对其获能效果进行检验。结果表明,采用肝素上游法孵育40 min处理后,精子的获能比例显著高于其他各处理组（P<0.05）,说明肝素上游法可以较好地诱发猪精子在体外获能。     

绵羊精液不同处理方法对体外受精效果的影响

试验通过开展绵羊低温保存精液和冷冻精液制备精子对体外受精效果影响的研究,旨在探讨制备绵羊IVF优质精液的新方法。结果表明:利用低温保存精液和冷冻精液,分别采用Percoll离心法和上游法制备精子进行体外受精,低温保存精液上游法的卵裂率78.6%显著高于低温保存精液和冷冻精液Percoll离心法和60.2%、62.3%,(P<0.05),极显著高于冷冻精液上游法21.1%,P<0.01;低温保存精液和冷冻精液Percoll离心法组间无显著(P>0.05)差异,但均显著(P<0.05)高于冷冻精液上游法。低温保存绵羊精液可用于制备IVF精子,上游法优于Percoll离心法,可显著提高体外受精效果。     

精子不同处理和胰岛素不同浓度对猪卵母细胞胞质内单精子显微受精的影响

探讨了分别使用新鲜、冷冻和超声波断尾精子以及在胚胎培养液中分别添加不同浓度胰岛素对猪卵母细胞胞质内单精子显微受精(ICSI)胚胎早期发育的影响.结果:(1)使用冷冻解冻精子与新鲜精子相比对猪卵母细胞ICSI后的卵裂率和囊胚率均无显著影响(P＞0.05);2)精子断尾与否对猪卵母细胞ICSI后的分裂率和囊胚率没有显著影响(P＞0.05);3)在胚胎培养液中添加5 mg/L胰岛素与对照组相比可显著提高猪ICSI胚胎的囊胚发育率(18.22% vs 3.60%,P＜0.05).     

水蛭素对猪精液冻后质量的影响

试验用含不同浓度(0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%)水蛭素的稀释液稀释美系公猪精液,并以0.25mL细管分装冷冻。结果显示:(1)水蛭素浓度为0、0.02%时在冻后精子畸形率或水蛭素浓度为0、0.12%时冻后精子顶体完整率上存在明显的品种效应(P0.05);(2)3种公猪各浓度组(除大约克和杜洛克公猪0.02%浓度组外)冻后精子活力均显著高于对照组(P0.05),且均在浓度为0.08%时最高;除了长白公猪0.02%浓度组冻后精子畸形率显著低于对照组(P0.05)外,3种公猪各浓度组与对照组差异均不显著(P0.05);大约克公猪各试验组、杜洛克公猪0.08%浓度组及长白公猪0.02%、0.06%及0.08%浓度组冻后精子顶体完整率显著高于对照组(P0.05),且均在浓度为0.08%时最高,长白及杜洛克公猪其他试验组与对照组差异均不显著(P0.05)。结果表明,适宜浓度的水蛭素可以显著提高猪精液冻后质量,效果最好的浓度为0.08%。     

猪精液4℃低温保存技术的研究

以精子总存活时间、有效存活时间及存活指数为检测指标,用6种稀释液稀释后4℃低温保存,从中筛选效果最好的基础稀释液配方,并进一步探讨保存前不同精液处理方法在猪精液4℃低温保存的效果;最后用筛选得出的基础稀释液和精液处理方法稀释猪精液,4℃低温保存2~3 d,用于低剂量常规部位人工授精试验,通过受胎率来探讨其繁殖潜力。结果表明:6号稀释液显著优于其他5种稀释液(P0.05);精液带精浆直接稀释的效果优于精液离心处理(P0.05);精液以1:2或1:3比例稀释更利于猪精液4℃低温保存(P0.05);低温保存猪精液低剂量常规部位人工授精是可行的。总之,通过试验得到了猪精液低温保存基础稀释液配方及保存前处理方法,该方法适合于低剂量常规部位的人工授精。     

猪卵母细胞电激活方法初探

本实验比较了已报道的4组常用的猪卵母细胞电激活方法,并对电激活参数进行系统探索。结果表明:电激活参数(125 V/mm,80μs,1 DC),激活液0.3 mol/L甘露醇+0.1 mmol/L MgSO4+0.1 mmmol/L CaCl2+0.01%PVA的激活方案,囊胚发育率显著优于其他3组方案(25.6%vs 12.6%vs 21.5%vs 15.2,P<0.05);脉冲电压100 V/mm时3次脉冲激活组囊胚发育率优于2次和1次脉冲组(27.3%vs 16.2%vs 21.7%,P<0.05);激活液中Ca2+浓度(0.1%,0.05%)对激活效果无显著影响,囊胚发育率分别为36.5%和40.9%;本实验结果中电激活效果明显优于化学激活(46.3%vs 29.4%,P<0.05)。通过上述实验本研究建立了一种优化的猪卵母细胞电激活方法,为生产单精子显微注射与体细胞核移植猪奠定了基础。     

银黑狐繁殖季节不同时期精液品质变化规律的研究

选取90只10月龄银黑狐,研究繁殖季节4个不同时期的精液品质变化规律。结果表明:精子浓度初期、中期和后期显著高于末期(P0.05);活动精子比率、精子顶体完整率、直线运动速度(VSL)和曲线运动速度(VCL)中期和后期显著高于末期(P0.01或P0.05);精子畸形率中期显著低于其余3个时期(P0. 01);精子的运动性、平均路径速度(VAP)中期显著高于初期和末期(P0.05或P0.01)。说明繁殖季节中期和后期精液品质优于初期和末期,建议生产中银黑狐精液采集以2月初至3月中旬为最佳阶段。     

紫花苜蓿鲜草对公猪精液品质的影响

为研究紫花苜蓿对公猪精液品质的影响,试验以28头采精公猪为研究对象,采用完全随机设计,分为4个处理,每个处理7头猪。对照组饲喂基础饲粮,3个处理组分别在基础饲粮中添加25%、40%和50%紫花苜蓿鲜草。结果表明:1)在种公猪饲粮中添加25%、40%、50%紫花苜蓿鲜草,采精量、精子密度略有降低,精子活力略有增加,但均未达到显著水平(P0.05);2)同一处理不同品种公猪采精量、精子活力差异不显著(P0.05),对照组与25%紫花苜蓿鲜草组长白公猪精子密度显著或极显著大于杜洛克公猪,但随着紫花苜蓿鲜草添加量增加到40%、50%,品种间精子密度差异不显著(P0.05);3)不同处理同一品种公猪的采精量、精子密度、精子活力差异不显著(P0.05);4)各处理组间干物质、粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪消化率及公猪体重差异不显著。结果显示,饲粮中添加不同比例紫花苜蓿鲜草可一定程度提高精子活力,节本增效显著。     

不同精液稀释液对微胶囊化保存的猪精子质量的影响

为了提高微胶囊化保存的猪精子质量,筛选适宜微胶囊化保存的猪精子稀释液,试验将猪精液用A、B 2种稀释液稀释为1×108个/m L浓度,利用海藻酸钠和钡离子反应制成猪精子微胶囊,测定其对微胶囊化保存猪精子质量及精子缓释率的影响。结果表明:在17℃条件下保存48小时和72小时稀释液B组的精子活率显著高于稀释液A组(P0.05),而且在保存1~72 h的各阶段,稀释液B组的精子畸形率显著低于稀释液A组(P0.05);精子在37℃条件下培养6小时和24小时稀释液B组的精子缓释率显著低于稀释液A组(P0.05)。说明稀释液B较适宜作为猪精子微胶囊化保存的稀释液。     

不同因素对奶牛分离精子ICSI效率的影响

本研究旨在探讨不同的联合激活处理、精子预处理方法和单精子注射方式对奶牛分离精子ICSI效率的影响。借助显微操作仪将经不同预处理的奶牛分离X精子直接注入体外成熟22～24h的牛卵母细胞胞质内,注射过程采用回吸胞质和不回吸胞质2种处理,最后分别用3种激活方案对注射卵进行激活。结果表明:用CR1aa+Ionomycin+6-DMAP对ICSI注射卵进行激活后,卵裂率和囊胚率都高于A23187+CHX和7%ET+CHX两种联合激活组(63.74%vs61.09%、53.75%;28.54%vs17.68%、22.00%,P0.05);采用percoll密度梯度离心法处理精子,卵裂率(77.10%vs62.19%,P0.05)与囊胚率(26.95%vs22.82%,P0.05)均高于上游法处理组;ICSI时回吸胞质获得的注射卵,其卵裂率和囊胚率均显著高于不回吸胞质处理组(63.10%,25.35%vs41.56%,19.40%,P0.05)。结果表明,用percoll密度梯度离心法处理精子、注射时回吸胞质、用CR1aa+Iono-mycin+6-DMAP激活ICSI注射卵,可显著提高奶牛分离精子ICSI的效率。     

Sch B对猪精液常温保存效果的影响

为了研究五味子乙素(Sch B)对猪精液常温保存效果的影响,本实验设计6个猪精液常温保存稀释粉配方,在筛选出的最佳自配基础稀释粉配方中添加了0、1、5、10、15μmol/L的Sch B,通过检测精子活率、质膜完整性、顶体完整性以及总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量,分析Sch B对猪精液常温保存效果的影响。结果表明:6号基础稀释粉猪精液常温保存效果最佳,有效保存时间为4d,精子活率为0.63,质膜完整率为59.33%,顶体完整率为78.29%,均显著高于其他处理组(P0.05);在6号自配基础粉中加入10μmol/L Sch B猪精液的有效保存时间为5d,精子活率达到0.61,T-AOC浓度为4.85 U/mL,显著高于其他处理组(P0.05),并使MDA浓度显著降低为1.44nmol/mL(P0.05)。因此,基础稀释粉中添加Sch B可提高猪精液常温保存品质,延长精子有效保存时间,其最佳添加量为10μmol/L。     

不同品种和季节对种公猪精液品质的影响

为研究不同品种和季节对公猪精液品质的影响,以28头长白公猪、87头大约克公猪、98头杜洛克公猪为研究对象,对其3年的精液品质进行了检测和分析。结果表明,杜洛克公猪的采精量显著或极显著小于长白、大约克,大约克公猪的精子活力显著优于长白公猪(P0.05),不同品种的精子密度差异不显著(P0.05);长白、大约克公猪的采精量以冬季最多,3个品种公猪的精子密度夏季显著或极显著小于冬季,精子活力四季差异不显著(P0.05);在同一季节,杜洛克公猪的采精量均小于长白、大约克,且冬季显著小于长白(P0.05),精子密度优于长白、大约克公猪(P0.05),大约克公猪的精子活力优于长白、杜洛克。结果显示,品种和季节对公猪精液品质有一定影响,炎热夏季做好猪舍的防暑降温工作,有利于改善精液品质。     

β-谷甾醇、淫羊藿苷对猪精子体外获能效果的影响

探讨中药单体成分β-谷甾醇(β-sitosterol)、淫羊藿苷(Icariin,Ica)对猪精子体外获能的影响,以期提高体外受精效果.以mTBM+肝素获能液为对照组,分别添加β-谷甾醇、淫羊藿苷的低、中、高3个剂量为试验组,利用金霉素荧光染色(chlortetracycline,CTC)法结合体外受精检验体外获能效果.在mTBM+肝素中添加β-谷甾醇2(中剂量0.08 mg/L)、淫羊藿苷2(中剂量17 mg/L)的B型精子率(获能精子)显著高于对照组和其他剂量组(P＜0.05),F型精子率(未获能精子)显著低于对照组和其他剂量组(P＜0.05),AR型精子率(发生顶体反应精子)与对照组和其他剂量组差异不显著(P0.05),卵裂率和囊胚率均极显著高于对照组和其他剂量组(P＜0.01);表明中药单体成分β-谷甾醇、淫羊藿苷能够显著促进猪精子体外获能效果.     

转pGH IGF-1基因对猪生长和繁殖性能的影响

为了解转双基因在猪生长发育中作用及意义,选取23头健康仔猪,其中转p GH、IGF-1双基因猪4头,转p GH基因猪12头,非转基因猪7头,研究p GH、IGF-1基因对猪生长和繁殖性能的影响。结果表明,转p GH、IGF-1双基因猪个体均重比转p GH单基因猪高2.83%,差异显著(P0.05);转双基因猪比非转基因猪高7.37%,差异显著(P0.05)。转双基因猪体重达100 kg的日龄比转单基因猪少8.93 d,差异显著(P0.05),转双基因猪比非转基因猪少12.23 d,差异显著(P0.05),转单基因猪比非转基因猪少3.30 d,差异不显著(P0.05);转双基因公猪的精液量,分别比转p GH单基因公猪与非转基因公猪提高27.61%、18.31%,差异均显著(P0.05);精子密度,三者之间差异均不显著(P0.05);转双基因公猪与非转基因猪的精子活力之间差异不显著(P0.05);转单基因公猪畸形率分别比转双基因公猪、非转基因猪高23%、18%,差异均显著(P0.05)。为进一步分析p GH-IGF-1生长轴对家猪生产性能的具体影响提供参考依据,也为转基因技术的推广与应用提供有力依据。     

维生素E对猪精液常温负压保存效果的影响

为了探究不同浓度维生素E在负压(-0.04 MPa)条件下对猪精液常温(17℃)保存效果的影响，试验将猪精液分为A～D组，分别在含0,0.1,0.5,1 mg/mL维生素E的Modena基础稀释液中保存，用全自动精子质量分析仪检测猪精子质量指标及畸形率，用相应试剂盒检测总抗氧化能力(T-AOC)及H₂O₂含量，用酸度计检测猪精液pH值。结果表明：在精液保存至第7,11天时，C组精子活率显著高于其他各组(P<0.05),且在保存至第1～5天时精子活率高于60%;在精液保存期间，C组精子活力高于其他组，且在第9天显著高于其他组；在精液保存期间，C组精子平均直线速度、平均曲线速度、平均路径速度及鞭打频率均高于其他组，畸形率低于其他组；在精液保存至第9天时，C组精子T-AOC显著高于其他组(P<0.05);在精液保存至第9,11天时，C组H₂O₂含量显著低于其他组(P<0.05);在精液保存期间，C组pH值的下降趋势相较其他组最缓慢，pH值最高，使猪精子处于较为适宜的弱酸环境中。说明将0....     

使用流式细胞仪分离精子进行仔猪性别控制的研究

本研究旨在探索流式细胞仪分离精子在猪性别控制中的应用。使用流式细胞仪分离猪XY精子,而后通过母猪输卵管授精生产"预知"性别的仔猪,并使用吖啶橙染色法检测粗分离对精子核酸含量的影响。结果,成功利用分离获得的猪X和Y精子对母猪进行输卵管授精,母猪怀孕率、产仔率均为100%;输Y精子母猪产仔雄性率100%(♂6/6),对照母猪产仔雄性率57.14%(♂8/14);3头输X精子母猪产母仔率91.67%(♀11/12),对照母猪产雌性仔猪40%(♀2/5);使用性别分离精子不影响母猪的怀孕率、产仔率,但窝产仔数较低;吖啶橙染色法检测结果表明,流式细胞仪粗分离对猪精子核酸含量没有显著影响(P>0.05)。本研究结果提示,使用流式细胞仪分离精子授精可以有效改变仔猪的性别比例。本研究结果为猪分离精子性别控制技术的推广应用奠定了基础。