宠物犬源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的检测及药物敏感性分析

floR是氟苯尼考特异性耐药基因之一,当前宠物犬源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的研究报道很少,故本试验利用PCR方法对宠物犬源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR进行检测,并采用微量肉汤稀释法测定宠物犬源大肠杆菌对10种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示,20株宠物犬源大肠杆菌中floR耐药基因的阳性菌株数为9株,阳性检出率为45%;对氟苯尼考的耐药率为65%,并呈现3~7重的多重耐药性。结果表明,随着氟苯尼考在兽医临床的广泛应用,其耐药率越来越高,需不断加强对氟苯尼考等抗菌药物的耐药性监控。     

氟苯尼考耐药基因floR LAMP检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且可定量检测氟苯尼考耐药基因floR的环介导等温扩增方法(LAMP),根据GenBank登录的革兰阴性菌floR基因保守序列,利用PrimerExploerV4设计特异性LAMP引物,成功建立了快速检测氟苯尼考耐药floR基因的LAMP方法。该LAMP检测方法反应温度为63℃,反应时间为60min,具有可实时监测反应、定量检测出floR基因的拷贝数,以及操作简便的特点,灵敏度高,检测限为6.24×100拷贝,是普通PCR的100倍。用建立的方法检测对氟苯尼考不同敏感性的大肠埃希菌floR基因,结果显示,对氟苯尼考敏感、中介和耐药的菌株均检测到floR基因,其拷贝数与菌株MIC相关,提示floR基因不仅存在于氟苯尼考耐药菌中。所建立的floR基因LAMP检测方法可为floR基因的监测,以及氟苯尼考耐药性产生和传播机制的研究提供新的技术手段。     

禽源多杀性巴氏杆菌耐药性分析及氟苯尼考耐药基因floR分布

为了解禽源多杀性巴氏杆菌的药物敏感性及氟苯尼考的耐药基因的分布特征,采用琼脂二倍稀释法,对分离自福建、广东和江西等南方数省部分地区113株禽源多杀性巴氏杆菌进行9种抗生素的耐药性分析,并应用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR的分布情况。结果显示:上述菌株对四环素表现高水平耐药,耐药率为65.49%(74/113);对链霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、氟苯尼考、卡那霉素与恩诺沙星表现中等水平耐药,耐药率分别是43.36%(49/113)、39.82%(45/113)、27.43%(31/113)、25.66%(29/113)与24.78%(28/113);对氨苄西林、头孢噻呋与头孢克洛较为敏感,耐药率分别为4.42%(5/113),2.65%(3/113)与1.77%(2/113);其中52.21%(59/113)菌株能耐受3类及3类以上的抗菌药物;氟苯尼考耐药基因floR的检出率为64.04%(72/113),且所有氟苯尼考耐药菌株均含有floR基因。结论:113株禽源多杀性巴氏杆菌存在多重耐药现象,且floR耐药基因较为流行。本研究结果为上述地区针对禽源多杀性巴氏杆菌临床用药提供科学依据。     

蛋鸡投喂氟苯尼考后大肠杆菌耐药性变化及耐药基因检测

为研究蛋鸡投喂氟苯尼考后大肠杆菌耐药性变化及耐药基因检出的情况,试验将60只1日龄京红1号蛋鸡随机分成试验组和对照组,另设苍蝇组(为鸡舍内飞蝇)。给药前常规饲喂和疫苗防疫,试验组于16周龄时连续5 d氟苯尼考混饲(200 mg/kg)给药,对照组不给药。采集试验组、对照组鸡泄殖腔棉拭子样品及苍蝇组样品各10份,进行细菌分离鉴定、最低抑菌浓度测定及耐药基因检测。结果显示,试验期40 d内,共分离鉴定获得大肠杆菌328株(78.1%),对照组、试验组和苍蝇组分离率分别为90%(126/140)、85%(119/140)和59.3%(83/140),差异显著(P0.05)。对照组和试验组MIC90值未呈显著差异,但试验组用药前后(1~5 d和6~40 d)呈显著差异(P0.05)。四种氟苯尼考耐药基因floR、fexA、fexB和pexA检出率分别为83.5%、2.1%、0.6%和0.9%。综上所述,试验组给药后虽然能够降低大肠杆菌分离率,呈现短暂性的MIC值升高,但是并不能直接导致大肠杆菌可持续性高水平耐药,floR基因流行率较高。因此,应当完善细菌监控措施,了解耐药性动态变化,防控动物源细菌耐药性的发生和蔓延。     

鸭源致病性大肠杆菌耐氟苯尼考floR基因的克隆与序列分析

为调查鸭源致病性大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的存在情况,利用PCR对20株临床分离的耐氟苯尼考的致病性大肠杆菌进行floR分子检测,分子检测结果显示,全部菌株floR基因阳性;对其中2株大肠杆菌的氟苯尼考耐药基因floR进行了克隆和测序,结果表明,鸭源大肠杆菌floR基因片段的克隆测序结果与预期所得片段结果相符,长度为753 bp,2株鸭源大肠杆菌floR基因的同源性为99.6%,与牛源、鸡源等floR基因的同源性为84.8%~99.9%。系统发育分析发现,2株鸭源大肠杆菌floR基因不在同一支上,亲缘关系较远,表明floR基因的亲缘关系与该基因的来源动物无关。     

牛源致病性大肠杆菌耐氟苯尼考floR基因的克隆与序列分析

对临床分离的12株牛腹泻大肠杆菌进行了血清型鉴定，毒力因子分析和MIC。值测定。利用PCR方法对上述致病性大肠杆菌进行了floR基因的检测，其中5株floR阳性。对其中的3株大肠杆菌的耐氟苯尼考floR基因进行了克隆和序列分析。结果表明，克隆的floR基因所推倒的氨基酸序列与其他12-跨膜外输泵家族在共同的基序上是保守的，在克隆的floR序列与已报道的floR序列间仅存在1个或2个氨基酸替代。     

鸭源致病性大肠杆菌耐氟苯尼考floR基因的克隆与序列分析

为调查鸭源致病性大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的存在情况,利用PCR对20株临床分离的耐氟苯尼考的致病性大肠杆菌进行floR分子检测,分子检测结果显示,全部菌株floR基因阳性;对其中2株大肠杆菌的氟苯尼考耐药基因floR进行了克隆和测序,结果表明,鸭源大肠杆菌floR基因片段的克隆测序结果与预期所得片段结果相符,长度为753 bp,2株鸭源大肠杆菌floR基因的同源性为99.6%,与牛源、鸡源等floR基因的同源性为84.8%～99.9%。系统发育分析发现,2株鸭源大肠杆菌floR基因不在同一支上,亲缘关系较远,表明floR基因的亲缘关系与该基因的来源动物无关。     

乌鲁木齐市宠物猫源大肠杆菌耐药性及耐药基因检测

为了解宠物猫源大肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药性及其耐药基因携带情况,在乌鲁木齐市多家宠物医院采集宠物猫肛拭子样品59份进行大肠杆菌的分离鉴定,通过琼脂稀释法测定10种抗菌药物的最小抑菌浓度,利用PCR方法检测13种耐药基因。结果:分离鉴定出大肠杆菌47株,分离率79.7%(47/59)。分离菌对四环素(TET)(83.0%)、阿莫西林-克拉维酸(A/C)(66.0%)和磺胺异噁唑(FIS)(66.0%)耐药情况严重;对头孢他啶(TAZ)、头孢曲松(CRO)、恩诺沙星(EN)、庆大霉素(GEN)耐药率在38.3%～48.9%;对环丙沙星(CIP)、阿米卡星(AMK)敏感性较好,未检出亚胺培南耐药菌株。菌株多药耐药分布在5～8耐,占比59.6%,耐药表型以1耐TET和6耐A/C+GEN+CRO+TAZ+TET+FIS为主。共检出ant(3″)-Ia、aac(6′)-Ib、bla_TEM、bla_CTX-M、qnrS、tetA、tetB、tetM、sulⅠ、sulⅡ10种耐药基因,检出率分布在8.5%～57.4%,未检出耐药基因oqxB、bla     

仔猪腹泻源大肠杆菌耐药性调查及耐药基因检测

对泰州地区分离的仔猪腹泻源大肠杆菌的耐药性及其携带的相关耐药基因情况进行检测,为养殖场今后合理用药提供科学依据。采用微量肉汤稀释法对分离的49株大肠杆菌进行8种抗菌药物的药敏试验;采用PCR方法对多黏菌素耐药基因mcr-1及超广谱β-内酰胺酶(ESBL)耐药基因blaCTX-M、blaSHV和blaTEM进行检测。药敏试验结果显示:大肠杆菌对氯霉素、氟苯尼考、氨苄西林、四环素、庆大霉素和恩诺沙星等的耐药率分别达到100%、97.96%、95.92%、89.80%、59.18%和51.02%;而对多黏菌素E和头孢噻呋的耐药率也达到44.90%和32.65%。进一步耐药基因检测结果显示:ESBL耐药基因中blaCTX-M的检出率最高,达到12.24%(6/49);其次为blaSHV,8.16%(4/49);有一株大肠杆菌携带blaTEM基因。其中一株同时携带blaCTX-M和blaSHV。多黏菌素耐药基因mcr-1的检出率达到30.61%(15/49),其中4株同时携带blaCTX-M基因。泰州地区分离大肠杆菌耐药情况和多重耐药现象较为严重,多黏菌素耐药基因mcr-1及ESBL耐药基因blaCTX-M、blaSHV和blaTEM的广泛分布表明这些耐药基因存在快速传播的风险。因此,有必要加强猪场细菌耐药性监测。     

活禽产业链中大肠杆菌耐药性及耐药基因调查

为了解家庭农场供货模式下"养殖-销售"活禽产业链中各环节大肠杆菌耐药性及耐药基因流行情况,本研究共采集132份来自自贡市沿滩区某一农贸市场及其活禽供货的33家家庭农场的样品,通过细菌分离纯化、形态学鉴定、特异性引物PCR检测、系统发育群PCR检测、药敏试验及耐药基因鉴定等方法对细菌特性进行分析。研究结果显示,83株分离株在伊红美蓝培养基上形成带有金属光泽的黑色菌落,镜检显示为革兰阴性短杆菌,且特异性引物检测结果均显示阳性,因此,确定83株分离株均为大肠杆菌。系统发育群鉴定结果发现,83株分离株系统发育群集中于A群（53.02%）及B1群（20.48%）;药敏试验结果显示,83株菌株均为多重耐药菌,其中硫酸黏杆菌素、四环素耐药率最高,均为100%,氨苄西林、头孢呋辛、氨曲南、氟苯尼考耐药率均超过90%;耐药基因结果显示,mcr-1、mcr-3、bla_TEM、bla_SHV、bla_{CTX-M-group 1}、bla_{CTX-M-group 9}、qnrS、aac（6'）-Ⅰb-cr、tetA和tetB等耐药基因均有检出,检出率均低于对应抗菌药的耐药率,符合预期结果。此外,统计结果显示,家庭农场细菌耐药率和耐药基因携带率低于农贸市场。本研究结果表明,农贸市场成为活禽产业链中耐药菌及耐药基因的集散地,可为指导禽大肠杆菌临床检测、诊断及合理用药提供试验依据,同时为评估活禽产业链耐药性传播风险提供可靠数据。     

牛肉源大肠杆菌的耐药性检测及相关耐药基因分布

为了解牛肉源大肠杆菌的耐药性并检测其相关耐药基因分布,本研究选取了117株牛肉源大肠杆菌,经药敏纸片法对11种抗菌药物进行了药敏检测,并根据耐药表型利用普通和(或)多重PCR技术对耐四环素菌中tet(A)、tet(B)和tet(C)基因,耐氨苄西林菌中blaTEM1、blaPSE1和blaOXA1基因,耐链霉素菌中strA-strB、aadA1基因,耐磺胺类药菌中sul1、sul2和sul3基因进行了调查分析。结果显示,117株大肠杆菌对四环素、氨苄西林、链霉素和磺胺异恶唑的耐药率较高,分别为89%、42%、38%和22%。tet(A)基因是所有四环素耐药基因中最为流行的一种基因(55%);在检测的3个β-内酰胺类药物耐药基因中,最流行的为blaTEM1基因(73%);链霉素的耐药性主要由strA-strB基因(38%)编码;sul2基因在耐磺胺异恶唑菌中的检出率最高(77%)。结果表明本次分离的牛肉源大肠杆菌耐药非常严重,进一步肯定了肉牛业生产中抗菌药的使用对大肠杆菌耐药性的产生和发展所发挥的重要作用,提示食品动物养殖应严格控制饲料中抗菌药的滥用。     

规模化猪场猪大肠杆菌的耐药性及相关耐药基因检测

为了解贵州省某规模化猪场猪源大肠杆菌分离株的药物敏感性和耐药基因的存在情况,以期为进一步研究细菌耐药的分子机制和临床用药提供资料,试验采用药物敏感试验、耐药基因PCR检测、基因测序等方法.结果表明:经K-B法检测20株猪源大肠杆菌对15种药物的敏感性,环丙沙星、氨苄西林、吡哌酸和青霉素等药物的耐药性强;利用PCR扩增技...     

动物源性沙门氏菌的耐药性分析及氟苯尼考类耐药基因的鉴定

为了解动物沙门氏菌的流行情况和药物敏感性及氟苯尼考耐药株的耐药基因分布,本试验对临床上疑似患沙门氏菌病的病料进行病原分离和细菌的多重PCR鉴定;采用K-B法测定分离株对23种抗菌药物的敏感性;选择氟苯尼考耐药菌株扩增floR、fexA、fexB、cfr和pexA基因。结果显示,共鉴定出61株沙门氏菌,其中肠炎沙门氏菌10株,鸡白痢沙门氏菌12株,鼠伤寒沙门氏菌39株。所有菌株对青霉素、红霉素、万古霉素耐药,90.16%对6种及6种以上抗菌药耐药。floR基因广泛存在于鼠伤寒沙门氏菌氟苯尼考耐药菌株中(8/12,66.67%),未发现其他耐药基因。研究结果表明鼠伤寒沙门氏菌是鹅源分离株中的优势血清型;floR基因主要介导沙门氏菌对氟苯尼考耐药性,但可能还存在其他机制。     

洛阳地区规模化猪场大肠杆菌耐药基因检测及耐药性分析

为了掌握洛阳地区规模化猪场大肠杆菌耐药基因型及大肠杆菌耐药性的情况,试验采用分离鉴定、药敏试验、PCR检测及耐药基因测序等方法对洛阳地区大肠杆菌耐药基因型及耐药性进行研究。结果表明:采集的样品中分离出17株大肠杆菌;经K-B法药敏试验分析,青霉素、氨苄西林、红霉素、多西环素等药物的耐药性强;用PCR扩增技术检测大肠杆菌基因型,检出TEM、CTX-M、tet A、erm B、aac(3)-II 5个基因型;与Gen Bank中的相关序列进行比对,与耐药基因序列的同源性在97%以上。说明洛阳地区的大肠杆菌存在多种耐药基因类型,大肠杆菌的耐药性较强并且还存在多重耐药性。     

湛江地区水产养殖场大肠杆菌耐药性和耐药基因分析

从湛江地区3个水产养殖场分别采集各场的水、池塘底泥和土壤样品,分离鉴定大肠杆菌,调查水产养殖环境中大肠杆菌的耐药情况。采用PCR法鉴定分离菌株,通过纸片扩散法检测分离菌株对22种抗生素的耐药性,PCR法检测耐药基因的携带情况。结果显示,从水体、池塘底泥和土壤样品中共分离鉴定出90株大肠杆菌,分离菌株对青霉素、林可霉素和克林霉素的耐药率为100%;对磺胺异(口恶)唑、利福平、新诺明、阿莫西林和氟苯尼考的耐药率分别为90.0%、88.9%、80.0%、57.8%和48.9%;对头孢唑啉、头孢噻肟、阿奇霉素和多肽类、喹诺酮类、四环素类、硝基呋喃类抗生素的耐药率较低(1.1%～8.9%);对丁胺卡那霉素和庆大霉素的耐药率为0。分离的90株菌均至少对4种药物耐受,最多耐受14种药物,耐受9种药物的菌株数最多,且90株均为多重耐药菌株。该养殖场分离的90株菌中bla_CTX-M、aphA1、sul2、floR等6种耐药基因检出率较高(≥50%);aac(3)-Ⅱ、ereA、oqxB、tetM、sul1等5种耐药基因检出率较低(≤20%)。单株菌株至少检出1种耐药基因,最多检出1...     

养殖废水产ESBLs大肠杆菌多重耐药性及耐药基因检测

为研究养殖废水中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠杆菌的分布及其多重耐药性与耐药基因携带情况,本研究对泰安市污水处理厂污水中分离的50株产ESBLs大肠杆菌阳性菌株采用纸片扩散法测定其对19种常见药物的耐药表型。针对产ESBLs菌株的耐药基因设计6对特异性引物,对ESBLs阳性菌株采用PCR方法检测其耐药基因。结果显示,50株产ESBLs大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素表现出较强的耐药性,其中对氨苄西林、头孢噻吩、头孢噻肟呈100%的耐药性;对非β-内酰胺类抗生素同样呈一定耐药性;并且呈多重耐药性。PCR扩增结果显示,分离菌株均含有bla_(TEM)、bla_(CTX-M)基因,有5株含有qrB基因,32株含有qrS基因,有2株不含blaSHV基因,50株菌株均不含qrA基因。本研究表明:养殖场排放的污水已被产ESBL大肠杆菌严重污染,污水是这些耐药基因重要的存储库。且养殖污水中耐药菌通过污水排放最终进入到水环境中,其耐药基因可能在水环境的细菌之间进一步扩散,导致产ESBLs大肠杆菌表现出多重耐药性,同时这些产ESBL大肠杆菌会反过来再次感染动物,造成耐药菌在动物间的传播,甚至造成严重的感染。本研究对水是这些耐药基因重要的存储库这一结论提供了实验佐证。     

鸭源大肠杆菌耐药表型及耐药基因分析

为了解鸭致病性大肠杆菌耐药表型及耐药基因的情况,选取信阳地区分离的11株致病性大肠杆菌,采用药敏纸片法对17种抗菌药物进行药敏试验,并对29种耐药基因进行PCR检测。结果显示:11株鸭源致病性大肠杆菌均表现为多重耐药,耐6、8、9种药物的现象最为普遍。在检测的29种耐药基因中,最为流行的基因是AacC4和FloR基因,两种基因检出率均为100%。耐药基因与相关耐药菌株检出率基本呈正相关。表明11株鸭源致病性大肠杆菌耐药性高,耐药谱广,携带耐药基因现象普遍,结果为鸭致病性大肠杆菌的耐药现状与临床用药提供理论指导。     

氟苯尼考耐药菌的构建及大肠杆菌中FloR蛋白定位

通过对floR基因序列的分析,将扩增的包含floR基因上游调控序列及下游终止序列的约1550 bp DNA片段克隆到pGEM-T easy载体上,成功构建了pGEM-floR质粒,将质粒转入JM109中,药物敏感性试验显示构建的pGEM-floR/JM109基因工程菌对氯霉素和氟苯尼考高度耐药,对四环素和庆大霉素敏感.本试验成功构建了一个基因背景清楚且对氟苯尼考耐药的细菌模型,排除了细菌中其他氟苯尼考耐药基因或泵出蛋白对floR基因贡献细菌耐药表型及进一步试验的影响.分别提取CVM1841、pGEM-floR/JM109、pGEM/JM109和JM109膜蛋白,运用实验审制备的鼠抗GsT-FloR1抗体进行免疫印迹反应,蛋白定位显示FloR蛋白位于细菌的细胞膜上.本试验结果证实floR基因编码的蛋白位于细胞膜,并贡献细菌对氯霉素和氟苯尼考的交叉耐药性.     

大肠杆菌耐药基因定位及耐药质粒消除

对采集的9株野生型大肠杆菌在药敏试验的基础上,进行了耐药基因定位。结果表明,4个菌株的氨苄青霉素耐药基因位于质粒上,不同畜群来源菌株之间耐氨苄青霉素质粒存在差异。用中草药艾叶的乙醇提取物和蒸馏提取物对大肠杆菌庆大霉素耐药性及耐药质粒进行了消除试验,结果艾叶乙醇提取物的消除率最高可达69.4%。     

氟苯尼考耐药茵的构建及大肠杆菌中FloR蛋白定位

通过对floR基因序列的分析,将扩增的包含floR基因上游调控序列及下游终止序列的约1550bp DNA片段克隆到pGEM-Teasy载体上,成功构建了pGEM—floR质粒,将质粒转入JM109中,药物敏感性试验显示构建的pGEM-floR／JM109基因工程菌对氯霉素和氟苯尼考高度耐药,对四环素和庆大霉素敏感。本试验成功构建了一个基因背景清楚且对氟苯尼考耐药的细菌模型,排除了细菌中其他氟苯尼考耐药基因或泵出蛋白对floR基因贡献细菌耐药表型及进一步试验的影响。分别提取CVM1841、pGEM-floR／JM109、pGEM／JM109和JM109膜蛋白,运用实验室制备的鼠抗GST-FloR1抗体进行免疫印迹反应,蛋白定位显示FloR蛋白位于细菌的细胞膜上。本试验结果证实floR基因编码的蛋白位于细胞膜,并贡献细菌对氯霉素和氟苯尼考的交叉耐药性。