ssc-let-7c对猪甲状腺细胞体外培养增殖研究

Mi R-let-7c是let-7家族的主要成员之一,在甲状腺的生长发育过程中起着重要的作用。本实验通过体外转染mi R-let-7c类似物探索其对猪甲状腺细胞体外培养增殖的影响。观察猪甲状腺细胞在3D条件下的生长状况和猪甲状腺原代及传代细胞的形态变化,并计算细胞生长速度;通过实时荧光定量(q PCR)、MTT技术检测3组体外培养猪甲状腺细胞中mi R-let-7c的表达量和细胞增殖情况;利用在线预测软件mi RWalk2.0对mi R-let-7c的靶基因及其功能进行预测。结果表明:传代2代后的甲状腺细胞生长缓慢,且形态由圆逐渐变长。细胞免疫荧光鉴定结果发现有明显的绿色荧光,表明猪甲状腺细胞功能正常。荧光定量PCR结果显示管家基因Met-t RNA表达稳定,转染mimics组mi R-let-7c表达量明显高于其他2组。利用MTT法的细胞增殖实验中转染mimics组的OD值显著小于其他2组(P0.05)。利用在线预测软件发现mi R-let-7c的靶基因主要聚集在与胰岛素及癌症等相关的通路。本研究揭示了mi R-let-7c在甲状腺细胞生长过程中的重要作用,为研究mi R-let-7家族在调控猪生长发育过程中的作用提供了有益参考。     

猪miR-let-7i的组织表达谱分析

Let-7是最早发现的miRNA之一,参与动物多个器官发育的调控过程,也在多种癌症发生中发挥抑癌作用。本研究采用Rt-qPCR(PCR)方法首先检测金华猪不同发育时期肝脏组织中let-7家族成员之一的miR-let-7i的表达变化,同时比较金华猪和大约克猪心、肝、脾、肺、肾、胰脏、小肠和皮脂中miR-let-7i的表达差异。结果表明:miR-let-7i在金华猪肝脏发育过程中表达总体趋势为胚胎期低于生长阶段,幼年期低于成年期;比较不同猪种间组织表达差异发现,在胚胎80d时,miR-let-7i在小肠中的表达量最高,在心、肝、脾、肺、小肠、皮脂中,金华猪的相对表达量极显著高于大约克(P0.01),而在肾和胰脏中的表达却极显著低于大约克(P0.01)。在出生后90日龄时,miR-let-7i在金华猪的心、肺和小肠中表达较高,在约克猪的胰、心和脾脏中表达较高;金华猪的肝、脾、胰脏中miR-let-7i的表达量极显著低于大约克(P0.01),而在肺、肾、小肠、皮脂中极显著高于大约克(P0.01)。本研究为探究miR-let-7i在动物发育过程的功能和分子机制奠定了基础。     

金华猪和长白猪肠道产丁酸菌相对丰度与丁酸代谢的相关性分析

本试验旨在研究金华猪和长白猪各肠段主要产丁酸菌相对丰度及丁酸代谢的相关性。选取相同条件下饲养的240日龄金华猪和长白猪各10头,分别取不同肠段内容物,采用高通量测序技术分析不同肠段主要产丁酸菌的相对丰度,实时荧光定量PCR法测定产丁酸关键功能基因丁酰-CoA:乙酰-CoA转移酶和丁酸激酶相对表达量的变化,气相色谱法测定丁酸含量。结果表明:1)金华猪空肠和回肠布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、粪杆菌属(Faecalibacterium)和真杆菌属([Eubacterium] hallii group)相对丰度显著低于长白猪(P0.05),而颤螺旋菌属(Oscillospira)和罗斯伯里氏菌属(Roseburia)相对丰度显著高于长白猪(P0.05)。在金华猪和长白猪中,布劳特氏菌属、丁酸球菌属、粪杆菌属和真杆菌属相对丰度间均呈极显著正相关(r=0.48～0.88,P0.01)。2)金华猪回肠和结肠中丁酰-CoA:乙酰-CoA转移酶和丁酸激酶基因相对表达量显著低于长白猪(P0.05)。3)金华猪空肠、回肠、结肠中丁酸含量均显著低于长白猪(P0.05)。4)金华猪和长白猪肠道中丁酰-CoA:乙酰-CoA转移酶和丁酸激酶基因相对表达量与丁酸含量呈极显著正相关(r=0.570 4～0.722 1,P0.01);2个品种对比发现,长白猪相关系数均高于金华猪。由此可见,金华猪空肠和回肠产丁酸菌相对丰度显著低于长白猪,同时金华猪结肠产丁酸关键功能基因丁酸激酶和丁酰-CoA:乙酰-CoA转移酶相对表达量显著低于长白猪,与之相对应的是金华猪空肠、回肠和结肠中丁酸含量显著低于长白猪,这也在一定程度上解释了长白猪肠道丁酸含量高于金华猪的原因。     

不同品种猪肌内脂肪合成代谢相关基因表达水平的研究

为了研究肌内脂肪与脂类合成代谢相关基因的关系,试验采用荧光定量PCR的方法检测了8头乌金猪和6头长白猪背最长肌脂肪酸合成酶(FAS)、固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)和硬脂酰CoA去饱和酶(SCD)基因mRNA相对表达量,同时采用索氏提取法检测背最长肌肌内脂肪含量,并对两者进行相关性分析。结果表明:乌金猪FAS基因mRNA相对表达量极显著高于长白猪(P0.01);SCD基因mRNA相对表达量显著高于长白猪(P0.05);SREBP-1c基因mRNA相对表达量虽然高于长白猪,但差异不显著(P0.05)。乌金猪背最长肌肌内脂肪含量高于长白猪,且差异显著(P0.05)。乌金猪和长白猪的FAS和SCD基因mRNA相对表达量都与肌内脂肪含量呈极显著正相关(P0.01);乌金猪SREBP-1c基因mRNA相对表达量与肌内脂肪含量呈极显著正相关(P0.01),长白猪SREBP-1c基因mRNA相对表达量与肌内脂肪含量呈显著正相关(P0.05)。说明脂肪酸合成关键基因的mRNA相对表达量在乌金猪和长白猪间存在品种差异,这种差异可能是肌内脂肪含量不同的主要原因之一。     

金华猪与长白猪肠道IL-17C表达差异研究

白介素-17C(IL-17C)是IL-17细胞因子家族成员之一,在宿主先天免疫防御和炎症中发挥重要的作用。研究IL-17C在金华猪与长白猪肠道中的表达特性对于了解不同品种猪抗病力差异的分子机制具有一定的意义。本研究利用RT-PCR及免疫荧光的方法分析了IL-17C基因及其蛋白在金华猪与长白猪空肠及回肠中的表达情况。结果表明,金华猪及长白猪回肠中IL-17C的表达量均高于其在空肠中的表达量,金华猪IL-17C基因在空肠的表达量显著高于长白猪。     

巴马香猪ATP合成酶基因表达发育变化与肉质性状相关性研究

为了探讨ATP5B、ATP5H基因在巴马香猪和长白猪不同生长阶段背最长肌中的表达丰度与肉质性状之间的关系,揭示ATP合成酶基因对肉质的影响,试验采用荧光定量PCR技术分析了不同时期背最长肌中ATP5B、ATP5H基因mRNA表达量。结果表明:ATP5B、ATP5H基因mRNA表达量具有显著的年龄依赖变化,随着年龄的增加而呈下降趋势,在0日龄时明显高于其他日龄。0日龄时巴马香猪肌肉组织中ATP5B基因mRNA表达量显著高于长白猪(P0.05),ATP5H基因mRNA表达量显著低于长白猪(P0.05)。巴马香猪肌肉组织中ATP5B基因mRNA表达量与电导率、剪切力呈显著的负相关性(P0.05),ATP5H基因mRNA表达量与剪切力呈极显著的负相关性(P0.01),与肌内脂肪含量呈显著的负相关性(P0.05)。长白猪肌肉组织中ATP5B、ATP5H基因mRNA表达量与肉色、电导率、剪切力、肌内脂肪含量均无显著的相关性(P0.05)。     

不同品种断奶仔猪肠道发育的差异及与血清胰高血糖素样肽-2的关系

为考察不同品种断奶仔猪小肠发育的差异及肠绒毛高度与血清GLP-2的关系,本试验分别测定了不同品种仔猪24、26d和30d时的血清GLP-2浓度及30d时肠道发育参数,并分析了回肠绒毛高度与GLP-2的关系。结果表明:大×太猪的小肠长(相对长)、小肠重(相对重)显著高于长白猪(P0.05),小肠重显著高于太湖猪(P0.05),而太湖猪小肠相对重显著高于长白猪(P0.05),小肠相对长极显著高于长白猪(P0.01);大×太猪和长白猪的回肠肠壁厚度、绒毛高度和隐窝深度显著高于太湖猪(P0.05);30d时,大×太猪血清GLP-2水平最高,且极显著高于长白猪和太湖猪(P0.01),3种猪回肠绒毛高度与血清GLP-2极显著相关(P0.01)。表明30d时的大×太猪肠道发育优于太湖猪和长白猪,不同品种断奶仔猪的小肠绒毛高度与血清GLP-2水平高度相关。     

甲状腺素对猪小肠上皮细胞miR-let-7a基因表达及细胞增殖的影响

miR-let-7a在动物细胞的分化、增殖与凋亡等方面发挥越来越重要的作用。甲状腺激素(TH)作用非常广泛,机体的每个细胞几乎都是TH作用的靶细胞,其可以促进组织分化、生长和成熟。本实验用甲状腺素(T4)浓度分别为(0、0.02、0.03、0.05、0.075、0.1、0.2μmol/L)在体外培养猪的小肠上皮细胞。结果表明:T4处理组的细胞体积形态相对于空白对照组没有明显变化;当T4添加浓度为0.03μmol/L时,细胞的增殖率显著低于其他组(P0.05);当T4浓度为0~0.03μmol/L时,let-7a的表达随着添加剂量的增加而升高,浓度从0.03~0.2μmol/L变化时,let-7a的表达呈现降低趋势,浓度为0.03μmol/L时表达量极显著高于其他组(P0.01)。let-7a的表达量与细胞增殖呈负相关。     

不同猪种泌乳期母乳外核体中let-7c表达模式研究

为了研究不同猪种泌乳期母乳外核体中let-7c的表达模式,试验采用荧光定量PCR(QPCR)方法检测了不同泌乳期(0,3,7,14,21,28天)的大约克夏猪和梅山猪母乳外核体中let-7c的发育性表达模式。结果表明:两个猪种不同泌乳阶段母乳外核体中let-7c的发育表达模式十分相似,总体趋势均表现为随时间推移而下降,且泌乳前期(0~3 d)免疫球蛋白(Ig E)的表达水平极显著高于泌乳后期(7~28 d)(P0.01);品种间分析结果显示,梅山猪母乳外核体中的let-7c表达水平在整个泌乳期均明显高于大约克夏猪。     

猪A-FABP基因真核表达载体的构建及其组织表达

本实验以长白猪背最长肌为实验材料,进行组织RNA的提取及A-FABP基因的克隆,构建p EGFPN1-A-FABP真核表达载体,并通过脂质体转染成纤维细胞,48 h观察荧光表达。同时应用荧光定量PCR法检测猪7种不同组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌)中A-FABP基因的差异表达。结果表明:成功构建p EGFP-N1-A-FABP融合表达载体,并在细胞中表达绿色荧光蛋白;A-FABP基因在7种组织中均有表达,其中背最长肌和腿肌中A-FABP基因的表达量最高,与其他组织相比差异极显著(P0.01),而脾脏和肾脏中的表达量相对于心脏、肝脏和肺脏差异显著(P0.05),而A-FABP基因表达量在心脏、肝脏和肺脏中差异不显著(P0.05)。表明该基因能够在真核载体和细胞中表达,并且在猪不同组织的表达具有差异性。     

宁乡猪不同杂交组合背最长肌肌苷酸含量与相关基因表达的关联性分析

为了探讨猪肌苷酸含量与相关基因表达的相关性,试验采用高效液相色谱法测定宁乡猪杂交组合杜×宁、巴×宁、巴×巴宁和巴宁×巴宁背最长肌肌苷酸含量,采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测背最长肌ADSL、GPAT和PURH基因的表达水平。结果表明:巴×宁猪肌苷酸含量显著高于巴×巴宁猪(P0.05);ADSL基因在巴×宁猪中的表达量极显著高于巴×巴宁猪(P0.01),GPAT和PURH基因在巴×宁猪中的表达量均显著高于巴×巴宁猪(P0.05);ADSL和GPAT基因表达量与肌苷酸含量均呈显著正相关(P0.05),PURH基因表达量与肌苷酸含量呈极显著正相关(P0.01)。说明ADSL、GPAT和PURH基因与肌苷酸沉积密切相关,可作为猪肉品质的选择依据。     

miR-450基因家族进化分析及其在沙子岭猪睾丸组织表达量分析

为探明miR-450基因家族(miR-450s)的系统进化历程及其在沙子岭猪睾丸组织不同发育时期表达规律。通过miRBase数据库检索miR-450s序列,利用Ensembl数据库信息确定miR-450s在不同物种中的基因组定位,采用MEGA 6.0构建miR-450基因家族的系统进化树,并利用RT-q PCR检测miR-450s在沙子岭猪睾丸组织不同发育期(E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180)的表达变化。miRBase数据库共检索15个物种36条miR-450s序列,且miR-450s序列具有高度保守性。基因组定位显示miR-450s位于X染色体上,均位于基因间隔区(Intergenic region,IGR),且miR-450基因家族成员在进化过程中紧密相连,可能由于串联重复所致。RT-q PCR结果显示,miR-450s在胚胎期中表达量显著高于出生后表达量(P0.01),且miR-450基因家族3个成员(miR-450a、miR-450b、miR-450c)在沙子岭猪睾丸不同发育阶段呈现出协同表达的特性。miR-450基因家族可能在猪睾丸组织发育过程中发挥重要调控作用。     

Pax7基因在猪不同组织中的表达特征及其在背最长肌中的发育性表达规律研究

本试验旨在探究Pax7(paired box 7)基因在猪不同组织中的表达特征及其在背最长肌中的发育性表达规律.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和Western blotting技术检测了Pax7基因在1日龄马身猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、下丘脑、小脑、背最长肌、腰大肌、股二头肌12种组织中的mRNA和蛋白质表达谱,以及马身猪和大白猪从出生1日龄到180日龄7个发育阶段(1、30、60、90、120、150、180日龄)背最长肌中的发育性表达规律.结果表明,Pax7基因mRNA在背最长肌、腰大肌、股二头肌、下丘脑和小脑组织中表达,而Pax7蛋白仅在背最长肌、腰大肌和股二头肌中表达.背最长肌中Pax7基因mRNA和蛋白质的发育性表达趋势在马身猪和大白猪中基本一致.在mRNA水平上,30日龄的表达量最高,极显著高于其他日龄(P <0.01);1日龄的表达量次之;其他日龄维持低表达的稳定状态.Pax7蛋白表达量在1日龄时最高,极显著高于其他日龄(P <0.01);30日龄次之;其他日龄维持低表达的稳定状态.从出生1日龄到180日龄,马身猪背最长肌中Pax7蛋白的表达量均显著或极显著地高于大白猪(P <0.05;P <0.01).Pax7 基因的表达与组织、日龄及品种的遗传背景有关.     

五指山猪和长白猪断奶仔猪肠道免疫性能及微生物多样性比较分析

【目的】探讨早期断奶对五指山猪和长白猪小肠肠道免疫性能及微生物多样性的影响差异。【方法】选择生长发育及营养状况良好、28日龄断奶的长白猪与五指山猪各6头,于50日龄采集小肠各段组织、内容物、黏膜,依次采用石蜡切片(HE染色)、16S rDNA V3-V4区基因高通量测序、实时荧光定量PCR测定,比较两品种间肠道形态学、肠道菌群及肠道黏膜免疫相关基因mRNA相对表达量的差异。【结果】(1)五指山猪空肠绒毛高度显著低于长白猪(P<0.05)。(2)长白猪十二指肠与回肠微生物多样性均较五指山猪更丰富(P<0.05)。(3)在门水平上,五指山猪空肠、回肠中厚壁菌门(Firmicutes)的丰度均显著高于长白猪,但变形菌门(Proteobacteria)出现相反的表达趋势(P<0.05)。在属水平上,五指山猪回肠中乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度显著高于长白猪(P<0.05)。(4)黏膜免疫相关基因表达量的检测结果显示,长白猪十二指肠中抑炎因子白细胞介素10(IL-10)和紧密连接蛋白闭锁小带蛋白1(ZO1)的mRNA表达量均显著高于五指山猪(P<0.0...     

盐津乌骨鸡ADFP、FATP1和ApoB基因表达量变化及其与脂肪性状的相关分析

为揭示脂肪分化相关蛋白基因(ADFP)、脂肪酸转运蛋白1基因(FATP1)和载脂蛋白B基因(Apo B)表达量变化对家禽脂肪沉积的影响,实验采用SYBR GreenΙ荧光定量法,首次测定了盐津乌骨鸡28、49、70、91、112 d皮脂、腹脂、肝脏和胸肌组织中ADFP、FATP1和Apo B基因的相对表达量。结果表明:ADFP基因在28 d各组织中表达量为肌肉腹脂皮脂肝脏,且胸肌中表达量显著高于其他3种组织(P0.05),在其他4个时间点各组织间表达量差异不显著(P0.05);FATP1基因在49 d各组织中表达量为胸肌腹脂肝脏皮脂,且胸肌中表达量显著高于皮脂(P0.05),在其他4个时间点各组织间表达量差异不显著(P0.05);Apo B基因在28、49、70、91、112 d 5个时间点各组织间表达量差异不显著(P0.05),但在肝脏中的表达量高于其他组织。3个基因表达量变化可能在脂肪沉积过程中发挥调控作用。     

藏猪促红细胞生成素(EPOR)基因的表达与低氧适应分析

为了解促红细胞生成素受体(EPOR)对动物低氧适应的重要作用,试验选取饲养在西藏林芝(海拔约3 000 m)的高原藏猪、高原大约克猪和饲养在北京(海拔约100 m)的大约克猪(低地大约克猪),在6月龄进行屠宰,采集心脏、肝脏和肺脏器官组织,使用荧光定量PCR技术测定EPOR基因的表达量。结果表明:猪EPOR基因在肺脏器官组织中表达量比较高,在心脏和肝脏器官组织中表达量较低。高原藏猪EPOR基因的表达量在3个器官组织中均高于高原大约克猪和低地大约克猪,但在肺脏器官组织中高原藏猪与高原大约克猪相比差异不显著(P0.05)。大约克猪从低地移居到高原地区,器官组织中EPOR基因表达量均显著增加(P0.05)。EPOR基因是受低氧调控的基因,低地大约克猪移居到高原之后该基因表达量增加;高原藏猪EPOR基因表达量高于大约克猪,可能对其高原适应性具有重要作用。     

鸭miRNA let-7-5p的分子生物学特征及功能预测

let-7通过影响靶基因的表达水平而参与细胞的生长、分化、凋亡等。为了研究let-7-5p在鸭上的序列特征、表达模式及其对鸭骨骼肌发育的可能作用,本文应用本课题组前期mi RNA测序数据,通过生物信息分析技术和分子生物学技术,研究了鸭let-7-5p序列特征、表达模式、其靶基因及靶基因的功能注释。结果如下:1鸭let-7-5p成熟序列是TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT;2鸭let-7-5p在北京鸭孵化第11天(E11)至E27胸肌内的表达量逐渐增加。组织间表达模式显示,在鸭E27心脏内的表达量最高(3.33),在肝脏、皮脂、肌胃、小肠和腹脂的相对表达量较低;3鸭let-7-5p靶基因的GO条目中许多条目与骨骼肌发育密切相关。研究结果能为进一步研究let-7-5p对鸭骨胳肌发育的作用奠定基础。     

从江香猪和大白猪不同组织中GYS1、GYS2基因表达水平的研究

旨在研究糖原合成酶(GS)基因mRNA在从江香猪和大白猪表达情况,探究肌肉类型糖原合成酶(GYS1)和肝脏类型糖原合成酶(GYS2)基因表达规律。以大白猪和从江香猪为试验动物,分别提取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、大肠、小肠、背最长肌、脂肪10个组织的总RNA,设计各自实时荧光定量引物,以猪GAPDH基因作为内参基因,应用实时定量PCR技术检测GYS1和GYS2基因不同组织中mRNA的相对表达量。结果发现:GYS1基因在大白猪和从江香猪所检测的组织中均有表达,在背最长肌中的表达量最高,且在大白猪背最长肌中表达量显著高于从江香猪(P0.05);GYS2基因在肝脏中表达量最高,其他组织中几乎不表达,具有肝脏组织特异性,且发现在从江香猪肝脏中表达量显著低于大白猪(P0.05)。本研究为GYS1和GYS2基因后续真核表达的研究提供了理论依据。     

不同品种猪背最长肌风味物质的研究

本研究选择肉质优良地方品种金华猪、金华猪与引进瘦肉型猪杂交品种以及国外瘦肉型品种大约克等,屠宰测定其背最长肌中肌苷酸、肌内脂肪以及氨基酸含量,探讨不同品种对肌肉风味物质以及营养价值的影响。结果表明:地方品种金华猪背最长肌肌苷酸含量显著高于国外瘦肉型品种和杂交品种(P0.05),肌内脂肪酸含量则是极显著高于其他品种(P0.01);在测定7个猪品种背最长肌的16种氨基酸中除亮氨酸外,品种间差异显著或极显著;金华猪背最长肌中16种氨基酸、氨基酸总量、鲜味氨基酸、必需氨基酸以及必需氨基酸占氨基酸总量的比值均高于国外瘦肉型品种大约克;杜洛克×金华和长白×金华的氨基酸总量、鲜味氨基酸、必需氨基酸均高于金华猪,但是3个品种间差异不显著(P0.05);7个品种中杜金×长大猪的谷氨酸含量为最高,显著高于长×大猪(P0.05),极显著高于其他品种(P0.01)。     

冷冻保存对猪耳成纤维细胞H19和IGF2R基因DNA甲基化和基因表达的影响

为探索冷冻保存对猪体细胞H19和IGF2R基因DNA甲基化的影响,本研究以梅山猪耳成纤维细胞为材料,采用亚硫酸氢盐测序和RT-PCR技术,检测了新鲜和冷冻保存细胞中H19和IGF2R基因的DNA甲基化状态和表达量,并对甲基化相关基因的表达水平进行分析。结果表明:冷冻组中H19基因DMR1和DMR3的甲基化率极显著高于新鲜组(P0.01),H19基因DMR2表现为去甲基化,极显著低于新鲜组中的甲基化率(P0.01),且该基因表达量极显著高于新鲜组(P0.01);冷冻组IGF2R基因DMR2表现为超甲基化,冷冻组极显著高于新鲜组中的甲基化率(P0.01),但IGF2R基因表达量无显著差异(P0.05);冷冻组中DNMT3A和DNMT1的基因表达量极显著高于新鲜组(P0.01),DNMT3B基因表达量则无显著差异(P0.05)。本实验条件下,冷冻保存影响了H19和IGF2R基因甲基化控制区的DNA甲基化状态,从而影响了该基因的表达水平。