鲤春病毒血症病毒核蛋白的原核表达及初步鉴定

为原核表达鲤春病毒血症病毒(SVCV)核(N)蛋白,本研究采用RT-PCR方法扩增SVCV N蛋白基因(SVCV-N),克隆于原核表达载体pET-28a(+)中,并转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达.SDS-PAGE分析表明,SVCV-N基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物约47 ku,与预期相符.Western blot检测表明,该重组蛋白可以被SVCV阳性血清所识别.     

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为获得针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)特异性的单克隆抗体(MAb),以纯化的SVCV为抗原,免疫BALB/c小鼠.将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选获得4个能稳定分泌抗SVCV MAb的杂交瘤细胞株;4个杂交瘤细胞制备腹水的MAb效价为1:160 000～1:640 000.亚型鉴定结果表明,这些MAb分属2个亚型(1F1、3E1,IgG2a;3F5、4F9,IgGl),轻链均为K链.Western blot分析显示,MAb1F1、3F5、4F9能特异性地识别SVCV的N蛋白(47 ku),3E1能特异性地识别SVCV的G蛋白(69 ku).采用相加ELISA法对抗原表位分析结果显示,1F1、3F5、4F9可能识别相同的表位,3E1则识别不同的表位.间接免疫荧光试验结果显示4株MAb均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色.这些MAb的制备为SVCV免疫学检测方法的建立奠定了基础.     

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体制备及鉴定

为制备鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体(MAb),本研究用纯化的SVCV免疫BALB/c鼠,通过杂交瘤细胞技术,制备2株抗SVCV的MAb,分别命名为2A3和3H7。经间接ELISA检测腹水效价为1:10240和1:12150。亚类鉴定证实,这2株亚类均为IgG1型。经非竞争酶免疫试验测定2A3和3H7的抗体亲和力常数分别为4.86×108L/mol和1.86×109L/mol,3H7相对亲和力高于2A3。MAb 2A3和3H7的饱和度均为1:400,叠加试验所得增值指数为63.2%,大于50%。抗体反应增值结果表明:两株MAb分别针对不同抗原位点。免疫印迹分析检测表明,两株纯化的MAb均可与SVCV抗原发生特异反应。     

鲤春病毒血症病毒新型液相芯片检测技术的建立

为建立检测鲤春病毒血症病毒（SVCV）的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中SVCV的G基因进行序列分析,设计SVCV特异性引物和探针并标记生物素,偶联荧光编码微球后与SVCV病毒RT—PCR产物杂交反应,用液相芯片仪器检测荧光信号。结果表明液相芯片检测体系能够正确的检测出SVCV。病毒核酸的最低检出量为10pg,检测特异性高,初步建立了检测SVCV的液相芯片技术,为进一步构建其他水生动物病原体全新快速高通量检测平台奠定基础。     

鲤春病毒血症病毒核酸适配体的筛选及分析

核酸适配体(Aptamer)是一类单链短DNA或RNA片段,具有一定的空间结构,对特定靶分子具有亲和力。本研究采用指数富集配体系统进化技术(SELEX),首次筛选出针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)的核酸适配体A2和A15,经过荧光PCR、凝胶阻滞和病毒中和实验,证明了其对SVCV具有结合力和抑制作用,在该病的检测和防治方面具有良好的前景。     

鲤春病毒血症病毒RT-RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种可现场快速准确检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法,本研究结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,根据SVCV L基因保守区域设计引物及探针,通过优化反应时间和温度等条件,初步建立了可用于SVCV现场可视化检测的RT-RAA-LFD方法。优化后的检测方法在35℃水浴锅中恒温反应15 min即可实现对SVCV目的基因片段的有效扩增。结果显示,该方法可以特异性的检测SVCV,并且不与病毒性出血败血症病毒、传染性鲑鱼贫血症病毒、病毒性神经坏死病毒等其他常见鱼类病毒发生交叉反应;对SVCV重组质粒标准品的检测限为2.42×10²拷贝/μL,并具有较好的稳定性和重复性;采用该方法和病毒分离、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、荧光定量RT-RAA共5种方法同时对45份临床样品检测,其中病毒分离、套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR均检测到29份阳性样品,荧光定量RT-RAA和本研究建立的方法均检测到28份阳性样品,本研究与前3种方法的阳性符合率为97.8%,与荧光定量RT-RAA的阳性符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的SVCV ...     

基于RPA的鲤春病毒血症病毒核酸检测技术的建立与评价

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)是近几年新发展并普及应用的一种核酸扩增技术,能够实现检测设备小型化,从而满足现场诊断(point-of-care testing,POCT)的需求。本研究以鲤春病毒血症病毒(springviraemiaofcarp virus,SVCV)为检测靶标,建立了SVCV的RPA检测技术,并分析了该方法的灵敏性、特异性和稳定性,评判了该技术应用于POCT的可能性。结果表明:基于RPA的检测方法灵敏度较高,检测下限可达4×10~3 PFU/mL,但比以Taq酶为基础的RT-PCR技术略低;特异性好,未发现对其他水生动物疫病病原,如传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)、传染性鲑鱼贫血病病毒(ISAV)等发生非特异性反应;稳定性良好,3次重复性试验的结果近乎一致。试验证明,该方法能够替代RT-PCR技术,应用于POCT的试剂和仪器设备研发。     

流式细胞仪在快速测定鲤春病毒血症病毒滴度中的应用

本研究建立了流式细胞仪快速检测鲤春病毒血症病毒（spring viraemia of carp virus,SVCV）滴度的方法。运用荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）技术检测SVCV A1株对草鱼性腺细胞系（GCO）的感染情况。用SVCV病毒单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠抗体为二抗,运用FACS来检测感染后不同时间点,以及不同病毒接种量的阳性细胞率。感染第3天时为最佳的病毒滴度测定时间点,测得SVCV的病毒滴度为8.31×105 FIU/mL,最低检测病毒滴度为（1000 FIU/mL）,与传统空斑试验（plaque assay,PA）相比,两种方法测得的结果基本一致。实验结果表明,FACS是一种简捷、高效、直接的检测SVCV滴度的方法,是一种新型的病毒滴度测定方法。     

鲤春病毒单克隆抗体的制备

鲤春病毒血症（Spring Viraemia of Carp，SVC）是鲤科鱼类的一种急性、高致死率的传染病，被国际动物卫生组织（OIE）列为必须申报的疫病之一。1971年欧洲人首先报道了鲤春病毒血症，有资料记载，该病曾给欧洲中部和东部的鲤鱼养殖业造成巨大的经济损失。2002年4月美国北卡罗来纳州某养殖场的135000尾锦鲤暴发传染病，发病率达10％，同年6月美国威斯康星州的野生鲤鱼也大量发病。随后确认两起疫病病原均为鲤春病毒（SVCV），经OIE设在英国的OIE参考实验室鉴定表明，该病毒株与1998年英国从中国进口的金鱼中分离到的SVC病毒株一致，并称之为“中国株”。此举直接把美国SVC病毒株的来源指向中国，对中国活鱼尤其是观赏鱼的出口构成了重大威胁。     

中国鲤鱼春季病毒血症毒株糖蛋白基因的亚克隆表达与纯化

为了控制一类传染病-鲤鱼春季病毒血症(SVC),本文亚克隆了SVC中国株糖蛋白基因(SVCV-C1 G),并采用pET21a-SVCV-C1 G/BL21(DE3)表达系进行了表达。随后,纯化了SVCV-C1 G蛋白,纯化蛋白分子量为49.5 kDa。SVCV-C1 G蛋白由442个氨基酸组成,与其他弹状病毒糖蛋白的同源性在18.4%~99.0%。系统进化树显示,SVCV-C1 G属于Ia亚型。研究结果为进一步研制SVC基因工程疫苗奠定了基础。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性分析

将非典型犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）基因克隆到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建含N基因的重组供体质粒pFastBac-N,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经筛选获得含N基因的重组Bacmid DNA（rBacmid-N）,脂质体法转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒vBacmid-N。用vBacmid-N感染昆虫细胞Sf9,免疫印迹（Western blot）分析,在62kDa处出现一条特异蛋白条带,与重组N蛋白的理论值相符合;间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescent assay,IFA）检测,vBacmid-N感染的昆虫细胞sf9出现特异绿色荧光。以纯化的重组N蛋白为抗原建立CDV抗体间接ELISA检测方法,犬CDV阳性血清A450大于0.40,而犬CDV阴性血清A450小于0.05,显示了良好的抗原特异性与稳定性。     

鲤鱼春季病毒出血症病毒G基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

采用RT-PCR方法扩增鲤鱼春季病毒出血症病毒（SVCV）的糖蛋白（G）基因,将PCR产物插入到杆状病毒转移载体pFastBac 1中,获得重组转移载体pFastBac 1-G,将其转化入含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含有G基因的重组穿梭质粒rBacmid-G。在脂质体转染试剂的介导下,将rBacmid-G转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。提取重组杆状病毒基因组,用M13引物PCR鉴定。对重组杆状病毒感染的sf9细胞,通过电镜观察、SDS-PAGE、Western blotting进行检测,结果表明,重组蛋白在sf9细胞中获得正确表达,相对分子质量约58 000,与鼠抗SVCV阳性血清具有良好的反应原性。本试验为研究鲤鱼春季病毒出血症病毒G蛋白的生物学活性和亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp5在真核细胞中的重组表达及鉴定

本文以嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得IBV非结构蛋白5(non-structural protein,nsp5)基因片段后,构建了杆状病毒重组质粒IBVnsp5-Bacmid。IBVnsp5-Bacmid转染Sf9细胞,获得nsp5重组杆状病毒,经(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot检测到转染细胞表达的nsp5蛋白。进一步从感染的细胞中纯化重组蛋白,并用纯化的蛋白免疫小鼠制备了抗nsp5的多抗血清,该多抗血清可检测到IBV四川株SC021202感染的DF-1细胞中特异性的nsp5蛋白。结果表明IBV nsp5在Bac-to-Bac真核表达系统中获得了成功表达,而且具有良好的免疫原性和反应原性。     

重组辛德毕斯病毒E基因痘苗病毒的构建

为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。     

禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术（SOE-PCR）获得了融合基因22-agS5B,将基因连接于表达载体pET32a（＋）,构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1mmol／L）诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。     

新城疫病毒特异性糖蛋白基因探针的制备及应用

应用ＲＴ－ＰＣＲ获取新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的部分囊膜糖蛋白基因片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,长为９２６ｂｐ,与预期结果相符;将该基因片段定向克隆入质粒载体ＰＵＣ１９只,得到重组质粒Ｐ９２６,酶切分析结果与已发表的ＮＤＶ毒株酶切位点一致。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因表达调控序列的初步解析

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是世界养猪业的一个巨大的威胁。近年来,此病给各国养猪业造成了巨大的经济损失。本文立足于反向遗传操作技术,介绍了调控PRRS病毒粒子的感染性、基因组RNA复制、亚基因组mRNA转录以及翻译等重要过程的顺式调控元件的一级序列和高级结构的最新研究进展。     

共表达Asia1口蹄疫病毒P1-2A-3C基因和猪IL-18基因重组鸡痘病毒构建及表达

为构建Asia1型口蹄疫重组鸡痘病毒疫苗,采集口蹄疫发病牛的水泡液及水泡皮,用RT-PCR法扩增出Asia 1型口蹄疫病毒的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切连接获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。再将P1-2A-3C片段与pUTAL-IL18片段连接起来,构建鸡痘病毒中间转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-IL18。通过脂质体转染法,将pUTAL-P1-2A-3C-IL18与鸡痘病毒282E4株共感染染鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblasts,CEF）,通过BrdU三次加压筛选,筛选出重组鸡病毒株vUTAL-P1-2A-3C-IL18。经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定,证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C基因。本研究为研制安全、高效的亚洲Ⅰ型FMD重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。     

狂犬病病毒磷蛋白在杆状病毒系统的表达及鉴定

为了建立狂犬病毒磷蛋白(phosphoprotein,P)的体外表达系统,本研究将RT-PCR扩增的狂犬病病毒ERA株P蛋白基因克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTA,构建重组质粒pFastBacHTA-P,并转染昆虫细胞Sf9包装形成重组杆状病毒。SDS-PAGE分析显示重组质粒pFastBacHTA-P转染的Sf9细胞中出现了分子量约为42 kDa的蛋白条带,Western blot证实分子量约为42 kDa的蛋白能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)分析进一步显示Sf9细胞表达的P蛋白与抗P蛋白单克隆抗体能特异性结合。这些实验证明,狂犬病病毒P蛋白不仅在Sf9细胞中获得表达,而且具有良好的免疫反应性。狂犬病病毒P蛋白杆状病毒表达体系的建立,为蛋白结构的解析和诊断试剂的研制奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒p30蛋白的表达及检测

根据禽网状内皮组织增生症病毒SNV株的前病毒基因组cDNA序列设计并合成1对引物,以pPB101质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒p30基因片段。将PCR产物克隆入表达载体pCold-HF中,构建的原核表达质粒pCold-p30转化BL21（DE3）菌,经IPTG诱导,p30蛋白呈现可溶性表达。用表达产物免疫6周龄BALB/c小鼠,制备p30抗体,经Westernblot和间接免疫荧光法检测,结果发现,原核表达的SNV株p30蛋白具有良好的免疫原性。