猪硒蛋白P基因克隆、鉴定及组织mRNA相对表达量分析

本试验旨在克隆、鉴定猪硒蛋白P基因(Sepp1),并探明其在猪不同组织中的mRNA相对表达量,为以猪为模型研究硒蛋白P(Sel P)的功能奠定基础。根据表达序列标签(EST)序列设计引物,利用c DNA末端快速克隆(3'-RACE)技术从猪肝脏总RNA中扩增出含开放阅读框(ORF)至poly A片段,然后与EST序列进行拼接;采用荧光定量PCR技术考察Sepp1在猪9个组织中的mRNA相对表达量。结果显示:1)扩增出共1 707 bp的片段,测序后与EST拼接获得了2 109 bp的猪Sepp1序列,并提交至NCBI Gen Bank数据库,序列号为EF113596.2;该基因1 170 bp的ORF编码区和对应的氨基酸残基与人相应序列分别有83.72%和75.64%序列同源性,其编码390个氨基酸,含有14个硒代半胱氨酸(Sec)残基,分别位于第59、267、286、309、311、327、339、352、354、361、376、378、385和387位。2)Sepp1 mRNA在猪组织中广泛分布,在肝脏中具有最高分布,依次为甲状腺肾脏睾丸下丘脑脾脏垂体心脏肌肉。本试验成功克隆、鉴定了猪Sepp1,检测了其在猪不同组织中表达分布情况,为其进一步以猪为模型探讨其功能奠定了基础。     

柞蚕溶菌酶基因的克隆和序列分析

采用cDNA末端扩增(RACE)方法及简并引物克隆了柞蚕溶菌酶(Antheraea pernyilysozyme)基因(Gen-Bank登录号:DQ353869)。该基因cDNA序列全长675 bp,由3个外显子和2个内含子组成,其开放读码框(ORF)长420 bp,编码140个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白的1-20位氨基酸为信号肽序列,21-140位氨基酸为柞蚕溶菌酶成熟蛋白(分子质量14 kD,等电点8.46)。柞蚕溶菌酶氨基酸序列中含有c型溶菌酶分子所特有的活性中心Glu32、Asp50以及8个半胱氨酸残基,与鳞翅目昆虫溶菌酶的氨基酸序列同源性较高,属非钙结合型c型溶菌酶。柞蚕溶菌酶的模拟三级结构与印度柞蚕(Antheraea mylitta)溶菌酶的三级结构十分相似。     

日本血吸虫PDIA3的原核表达和多抗血清制备

为获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)PDIA3(Sj PDIA3)重组蛋白,并制备多克隆抗体血清,本研究以日本血吸虫c DNA文库为模版,利用PCR技术扩增得到PDIA3 ORF全长,并克隆到p ET28a(+)载体中,将得到的重组质粒p ET28aSj PDIA3转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后His-Ni柱亲和层析纯化得到Sj PDIA3重组蛋白,利用重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,Western blot分析重组蛋白的免疫原性。扩增得到长为1482 bp日本血吸虫PDIA3的ORF序列,该序列编码493个氨基酸,含两个硫氧还原蛋白结构域和一段信号肽,无扩膜结构。在原核表达系统中表达得到大小为55 k Da的Sj PDIA3重组蛋白,分析显示其具有良好的抗原性。     

猪DECR1基因cDNA的克隆、序列分析及原核表达研究

旨在研究猪2,4-dienoyl-CoA reductase1(DECR1)基因的结构,揭示该基因的原核表达规律。试验以山西马身猪的肝脏组织为材料,采用RT-PCR与RACE技术克隆了DECR1基因的cDNA全序列,并将其重组于pET32a+原核表达载体中,经酶切、序列鉴定正确后,重组质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。结果表明:猪DECR1基因的cDNA全长2352bp,包括987bp的开放阅读框(ORF),53bp的5′非翻译区(UTR)和1312bp的3′-UTR;编码区(CDS)编码328个氨基酸残基与猪(电子预测序列)、牛、人、猩猩、猴、马、犬、鼠相应序列的同源性分别为99%、88%、88%、87%、87%、87%、87%和83%;SDS-PAGE电泳结果显示,在IPTG诱导4h时,外源蛋白表达效率最高;Western blot检测发现经诱导表达的蛋白产物大小约为35ku,与预测的大小一致。猪DECR1基因的克隆和表达研究,为进一步探究该基因的生物学功能及其分子遗传机制提供了理论基础。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因的克隆、表达及纯化

利用RT-PCR技术克隆了猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts882蛋白基因,测序结果表明：序列长度为270bp,包含258bp的编码区,编码85个氨基酸,与GenBank中西班牙分离株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为99％;将该基因成熟肽部分亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导后,进行SDS-PAGE初步分析,在34ku位置有1条蛋白条带,与预期结果一致。通过GST亲和纯化获得了较高纯度的重组融合蛋白,Westernblot结果表明,纯化后的重组融合蛋白可与兔抗全囊囊尾蚴血清发生特异性反应。排泄分泌抗原Ts882的成功表达、纯化为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。     

山羊FTL基因克隆、序列分析和组织表达研究

为了探讨山羊体内铁蛋白轻链(ferritin light chain, FTL)的结构及生物学功能,试验利用RT-PCR技术克隆得到山羊FTL基因序列,通过在线软件分析其生物学特性,构建物种进化树揭示物种间亲缘关系;根据克隆获得的FTL基因序列,通过实时荧光定量PCR技术检测山羊FTL基因在不同组织中表达水平;复苏前期保存的山羊肌内前体脂肪细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测FTL基因在诱导分化各时间点的相对表达量。结果表明：克隆获得的山羊FTL基因编码区(CDS)序列全长为745 bp,其中包括完整的大小为528 bp的ORF,共编码173个氨基酸;FTL蛋白有6个丝氨酸磷酸化位点,4个苏氨酸磷酸化位点,有23个带正电荷的赖氨酸和精氨酸残基,26个带负电荷的谷氨酸和天冬氨酸残基,无跨膜结构域;山羊FTL基因与牛进化亲缘关系最近;FTL基因在山羊体内各器官/组织中均有不同程度的表达,其中在肝脏中的相对表达量最高;FTL基因在24小时时相对表达量最高,24 h后的表达量呈不断下降的趋势。说明山羊FTL蛋白与脂肪代谢具有一定直接或间接关系。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GS株非结构蛋白基因的克隆及测序

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332毒株基因序列设计合成了9对引物,采用RT-PCR方法对PRRSV GS株的非结构蛋白基因ORF1进行了分子克隆,并对其核苷酸序列及编码氨基酸进行了分析。结果表明:ORF1全长11 882 bp,其中ORF1a核苷酸长7 512bp,编码2 503个氨基酸,ORF1b核苷酸长4 374 bp,编码1 457个氨基酸。PRRSV GS株ORF1基因与VR-2332株ORF1基因核苷酸同源性较高,其中ORF1a为89.3%,ORF1b为90.7%,而与LV株同源性相比较低,其同源性分别为54.3%和60.8%,相对ORF1a来说,ORF1b较为保守。ORF1编码的产物为2个聚合蛋白,ORF1a所编码的聚合蛋白经水解酶切割后产生6个成熟的非结构蛋白(NSP),其中NSP2变异最大,该蛋白具有耐受碱基插入、突变的能力,可能与PRRSV对组织细胞的亲嗜性有关;ORF1b编码的聚合蛋白经蛋白酶切割后,产生4个成熟的非结构蛋白。从系统发生树分析,PRRSV GS株非结构蛋白基因区域在基因型上属于北美洲型。     

金黄地鼠（Mesocricetus auratus）朊蛋白基因的克隆及其原核表达

采用RT-PCR技术从金黄地鼠(Mesocricetus auratus)脑组织获得朊蛋白基因(Prion protein nucleic acid,PRNP)开放阅读框(Open reading frame,ORF),截去其N端信号肽(66 bp)和C端GPI锚定位点(69 bp)形成朊蛋白编码区PRNPx;将编码区重组于融合表达质粒Pet-DsbA中,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中经IPTG诱导表达,并经Western-blot验证。结果表明,金黄地鼠PRNP基因ORF区全长为765 bp,编码254个氨基酸的前体蛋白,核苷酸序列与已发表金黄地鼠序列(M14054)同源性为99.87%,其第116个氨基酸发生了同义突变由GCT变为GCC;朊蛋白在大肠杆菌得到高效表达,产物是相对分子质量为47 000的融合蛋白。     

牛ARRDC3和ARRDC4基因的克隆和生物信息学分析

旨在对克隆的牛ARRDC3和ARRDC4基因特性进行分析。以人ARRDC3和ARRDC4基因序列作探针,BLAST获得牛的表达序列标签(ESTs)序列,并设计引物利用RT-PCR方法从牛肩胛骨肌肉克隆c DNA序列,填充牛表达序列标签序列间的空缺,得到牛ARRDC3和ARRDC4基因。序列分析表明,牛ARRDC3基因编码区长1 245 bp,编码414个氨基酸;牛ARRDC4基因编码区长1 242 bp,编码413个氨基酸。氨基酸分析表明,ARRDC3蛋白主要分布在细胞质,不属于分泌蛋白;其磷酸化位点分布于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上;二级结构预测以无规则卷曲为主;保守结构域预测含一Arrestin_C功能结构域。ARRDC4蛋白主要分布在细胞质和微体,不属于分泌蛋白;其磷酸化位点分布于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上;二级结构以无规则卷曲为主;保守结构域预测含两段低复杂度序列和一Arrestin_C功能结构域。     

猪Toll样受体3、7和8基因的克隆与序列分析

为了对猪Toll样受体(TLR)3、7和8基因进行克隆与序列分析,本实验从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中,利用RT-PCR方法分片段扩增猪TLR3、7、8基因,并克隆于pMD18-T载体中。根据测序结果分析,猪TLR3、7和8基因的ORF分别为2718bp、3153bp和3087bp,并分别编码906、1051和1029个氨基酸。同源性分析结果显示,它们与GenBank中登录的猪TLR的相应序列同源性达99%以上;与牛、马、羊和人的同源性较高,与鼠的同源性次之,与鸡的同源性最低,其蛋白分子结构预测表明猪TLR3、7、8均为跨膜蛋白。     

中国新吉细毛羊LHx2基因cDNA克隆与序列分析

以供试羊皮肤组织中提取的总RNA为模板,根据Gen Bank中登陆的绵羊LHx2基因序列设计引物,通过PCR方法扩增RT-PCR合成的LHx2基因编码区第一链c DNA,回收、纯化反应产物,将目的基因与p MD18-T载体连接、转化,获得阳性重组质粒,成功克隆新吉细毛羊LHx2基因c DNA序列,测序长为1 215 bp。基因同源性分析结果显示各物种间同源性均在80%以上。该基因编码405个氨基酸残基,蛋白同源性分析结果显示各物种间同源性差异较大;蛋白二级结构分析显示LHx2蛋白为疏水性蛋白、柔韧性较高;蛋白结构域分析结果表明克隆的基因较为完整。研究结果为深入研究新吉细毛羊LHx2基因提供理论基础。     

荣昌猪白细胞介素-2受体γ链基因克隆、表达与鉴定

运用RT-PCR技术从由刀豆蛋白(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)扩增出猪白细胞介素-2受体γ链基因的完整开放阅读框(ORF),长约1 107 bp,编码由368个氨基酸残基组成的相对分子质量为41 780的蛋白多肽.荣昌猪IL-2Rγ与人、猕猴、牛、犬、鼠在氨基酸水平上的同源性分别为81.6%,80.8%,85.1%,83.2%和68.8%.运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rγ,开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因,共1 020 bp.将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)后在E.coli BL21中诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为52 000,重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占茵体总蛋白的37.6%;Western-blotting分析表明,在相对分子质量52 000处有一奈特异性的带;对γ诱导重组茵进行转录检测得到约1 020 bp的特异性片段.     

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段的表达、纯化及抗原性分析

根据已克隆的戊型肝炎病毒株swCH189株结构蛋白基因（ORF2）的抗原性及水溶性分析,在其序列上设计套式引物,采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒（HEV）结构蛋白基因ORF2主要抗原基因片段,长度为728bp,将其克隆于PMD18-T载体,测序结果表明插入的片段属于猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因ORF2部分;将该片段插入pet32a表达载体,经酶切、测序鉴定证实获得了带有目的基因的重组表达质粒。将重组质粒转化Rosetta菌,经0.3mmol/L IPTG诱导得到融合表达,得到相对分子质量为45 000的重组蛋白,以包涵体形式存在。Western blot分析表明,该蛋白可以与猪戊型肝炎阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。并用SDS电泳切胶纯化和透析浓缩方法进行纯化,用纯化的蛋白免疫兔子,经每2周免疫1次,连续3次免疫后,对免疫组和对照组,分别在45,60,90d采血,每只兔子采集1份。用夹心ELISA法测定免疫血清抗体,结果表明免疫组在45d后均产生具有HEV抗原结合活性的抗体。本试验对猪swCH189株CP239基因的克隆和表达研究,为进一步研究结构蛋白基因ORF2的生物学功能奠定了基础。     

猪细小病毒NS基因原核表达与多克隆抗体制备

旨在制备抗猪细小病毒(PPV)非结构蛋白共有氨基酸的NS多肽多克隆抗体。根据GenBank(MK993540)公布的PPV基因组序列,克隆其非结构蛋白NS1、NS2共有基因序列(NS基因),并进行生物信息学分析。进而将NS基因克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-NS,转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达,利用镍柱亲和层析技术纯化表达的重组多肽,用重组多肽免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,PPV杨凌株NS基因长258bp,编码86个氨基酸的多肽,是具有亲水性的非跨膜NS多肽,具有大量的B细胞线性表位。NS多肽在37℃、0.8mol/L IPTG条件下,诱导6h有大量的可溶性表达。免疫印迹试验结果显示,该多肽具有较好的抗原性。用纯化NS多肽免疫小鼠后获得鼠抗NS多肽的血清抗体效价为1∶12800。用制备的NS多克隆抗体检测纯化的NS重组多肽及真核表达的NS1蛋白,均能检测出相应特异性条带,为进一步研究NS蛋白在PPV致病过程中的作用奠定了基础。     

禽腺病毒4型Penton和Fiber1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为开展禽腺病毒4型(FAdV-4)五邻体蛋白(Penton)和纤丝蛋白(Fiber1)多克隆抗体的制备及评价,研究通过对Penton和Fiber1基因优势抗原表位基因片段进行生物信息学分析,设计特异性引物PCR扩增获得Penton和Fiber1优势抗原表位基因片段,将其克隆至原核表达载体pColdⅠ,转入表达宿主菌BL21(DE3)进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,将纯化、鉴定后的目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,对抗体进行Western blot鉴定及间接ELISA抗体效价测定。结果可见,FAdV-4 Penton基因序列共编码525个氨基酸,Fiber1基因序列共编码432个氨基酸,其优势抗原表位点分别有7、6个区域,且均集中于N端;成功构建pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1重组原核表达质粒,其诱导表达的重组蛋白Penton和Fiber1均与His标签单抗发生特异性反应,动物免疫获得的Penton、Fiber1多克隆抗体均能与目的蛋白反应形成特异性条带,且Penton多克隆抗体效价高于Fiber1多克隆抗体。综上,研究获得的纯化重组蛋白Penton较Fiber...     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

猪YTHDF2蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

YTH家族蛋白2(YTH domain-containing family protein,YTHDF2)作为一种m~6A修饰的结合蛋白,可对底物mRNA的剪接,翻译,降解等过程进行调控。本研究通过RT-PCR首次获得了猪YTHDF2编码基因序列,全长1 743 bp,编码580个氨基酸,基因进化树分析显示该基因在各物种间保守性较高。将猪YTHDF2编码基因克隆至原核表达载体pET-28a (+)中,重组质粒pET-28a (+)-YTHDF2在大肠杆菌BL-21菌株中进行原核表达,成功获得了大量带His标签的猪YTHDH2重组蛋白,大小约70 kD。以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备猪YTHDF2多抗血清,ELISA结果表明制备的兔抗猪YTHDF2多抗血清效价为1:204 800,间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验均表明该多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。猪YTHDF2基因序列的获得及多克隆抗体的制备为进一步研究YTHDF2在猪mRNA m~6A甲基化过程中的生物学功能奠定了基础。     

猪热休克蛋白40(Hsp40)的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

克隆猪热休克蛋白40 (heat shock protein 40,Hsp40)基因并构建其原核表达载体,以纯化的猪Hsp40蛋白为抗原免疫兔制备抗猪Hsp40多克隆抗体。参照GenBank收录的猪Hsp40全基因序列,设计1对特异性扩增其CDS区全序列的引物,利用RT-PCR方法扩增猪Hsp40基因;扩增产物经双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1-His,测序无误后转化Arctic Express (DE3) RP感受态高效表达宿主菌,优化其表达条件(时间、IPTG浓度、温度)后,将可溶性的猪Hsp40重组蛋白用His-Band Ni^+层析柱进行纯化,用纯化的His-Hsp40重组蛋白免疫兔以制备多克隆抗体。采用抗原亲和纯化法对制备的多抗进行纯化,并采用间接ELISA法检测抗体效价。利用Western blot检测重组蛋白的免疫原性和反应原性,以及抗体的特异性。结果显示,克隆得到的猪Hsp40基因片段长度为1 485 bp,表达出的可溶性His-Hsp40重组蛋白相对分子质量约为57 800,制备出的猪Hsp40蛋白多克隆抗体效价为1∶512 000,且该多抗能够特异性识别His-Hsp40重组蛋白和猪肺泡巨噬细胞中的Hsp40蛋白。结果表明,成功克隆了猪Hsp40基因,表达并纯化了猪Hsp40蛋白,制备的兔抗猪Hsp40蛋白多克隆抗体能够有效地应用于猪Hsp40蛋白抗原的检测。     

禽流感病毒N3亚型神经氨酸酶基因的克隆

本研究应用11日龄SPF鸡胚增殖禽流感病毒标准株A/Duck/Germany/1215(H2N3),用LSTRIAZOLL试剂盒提取病毒RNA,应用自行设计的NA基因半特异性引物进行RT-PCR扩增,得到NA基因的全长DNA片段,克隆到PMD18-T载体上,并进行鉴定和序列测定.测定结果表明所获得的NA基因DNA片段长1451bp,编码469个氨基酸残基,与其他亚型的NA基因编码的氨基酸长度相一致.根据推导的氨基酸序列进行预测,该蛋白具有6个潜在的糖基化位点和19个半胱氨酸残基.与其他亚型的NA基因相比较发现克隆的NA基因符合神经氨酸的分子结构特征,本研究首次获得N3亚型NA基因全序列.     

成华猪γ-干扰素基因分子克隆与序列分析

为研究猪γ—干扰素在抗御传染性疾病和肿瘤生物治疗中的免疫增强作用，本实验以ConA刺激成华猪外周血淋巴细胞提取激活淋细胞的mRNA，设计合成特异的引物序列，应用反转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增和克隆成华猪IFN—γ基因并进行序列5ll定。成华猪IFN—γcDNA约长500bp，从第68位核苷酸开始编码其信号肽，到569位核苷酸为终止子。IFN—γ基因的开放框架(ORF)由498bp构成，编码166个氨基酸。成华猪IFN—γ与猪IFN—γ基因核苷酸间同源性为98％，在261—269存在点突变，在氨基酸水平完全一致。IFN—γ氨基酸与鼠同源性为30％，与人同源性为40％。