大麦CIPK基因家族鉴定及表达分析

钙调神经磷酸酶B样相互作用蛋白激酶(CIPK)蛋白家族是由Ca2+介导的植物信号通路中的关键蛋白家族,在植物抗逆和生长发育中起关键作用。本研究将生物信息学方法和转录组数据分析相结合,挖掘出大麦31个HvCIPK基因家族成员并将其分为5个亚家族。HvCIPKs基因家族成员具有CIPKs典型的N端激酶结构域和C端NAF调节结构域;蛋白质分子量在40302.27~89926.43KDa之间,为亲水性蛋白;启动子总共包含11种与非生物胁迫、激素调控以及生长发育相关的顺式作用元件;蛋白互作网络预测结果显示,HvCIPKs与Na+、K+转运体、ABA信号通路关键蛋白(SOS1、AKT1和ABL2)存在相互作用关系;转录组数据分析发现HvCIPK1、HvCIPK2、HvCIPK6、HvCIPK9、HvCIPK11受盐碱胁迫的诱导表达。该研究为进一步探索大麦HvCIPKs基因家族功能及调控机制提供理论依据。     

水稻抗白叶枯病相关基因的亚细胞定位

利用亚细胞定位技术对水稻抗白叶枯病相关基因的表达产物进行了分析,为基因功能分析提供了重要信息。通过前期基因芯片筛选、半定量/定量PCR的验证及基因功能注释,从高抗白叶枯病水稻品种Y73中筛选了18个潜在的与抗白叶枯病相关的基因,并在烟草叶片细胞中进行亚细胞定位分析。通过观察融合有绿色荧光标记(sGFP)的表达产物,初步了解这些基因在烟草细胞中的表达位置。经过激光共聚焦显微镜观察后发现: 其中4个基因的 sGFP 融合蛋白定位于细胞核上,可能发挥了转录因子的功能;4个基因的 sGFP 融合蛋白定位于细胞质膜上,推测可能与细胞质膜的稳定或控制蛋白转运相关;4个基因的 sGFP 融合蛋白同时定位于细胞核和细胞质膜上;另有6个基因的 sGFP 融合表达后没有观察到明显的定位信号。     

山羊BST-2基因的表达及其亚细胞定位

将山羊的BST-2基因 (Capra hircus bone marrow stromal antigen 2 gene)分别克隆至原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体p3×Flag-CMV-14中,获得了重组表达质粒pGEX-BST-2和p3×Flag-BST-2。将重组质粒pGEX-BST-2转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE及Western blot结果显示,诱导表达的重组蛋白分子量约为42 ku,与预期蛋白一致。利用脂质体介导转染法将重组质粒p3×Flag-BST-2转染Vero细胞,经激光共聚焦显微镜检测,结果显示,BST-2蛋白在细胞中可以良好表达,并主要定位于细胞膜上。     

水稻OsWRKY78与GFP融合基因的拟南芥转化及亚细胞定位

[目的]确定OsWRKY78蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中OsWRKY78全序列设计引物,进行OsWRKY78的RT-PCR扩增,克隆了OsWRKY78基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinGFP重组,并对重组载体进行菌液PCR和酶切验证,最后利用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥中,对其亚细胞定位进行研究。[结果]试验克隆得到了pBinGFP-OsWRKY78重组载体,经菌落PCR与酶切检测表明构建的表达载体正确,其转化到拟南芥中后得到了转基因植株,荧光显微镜检测结果表明,OsWRKY78基因表达产物主要定位在细胞核中。[结论]该研究结果为深入研究OsWRKY78基因的功能及其在相关信号传导中的作用奠定了基础,也为进一步研究OsWRKY78基因与褐飞虱之间的关系提供了理论依据。     

斜带石斑鱼PKR基因的克隆表达及亚细胞定位分析

根据实验室前期获得的斜带石斑鱼PKR基因的全长c DNA,对其原核表达、组织分布及亚细胞定位进行了研究分析。结果表明,斜带石斑鱼PKR基因c DNA全长为2 151 bp,其中ORF区为1 863 bp,编码621个氨基酸,表达蛋白的分子质量大小为70 157.15 Da,PI为5.72。通过NCBI网站上BLAST软件比对发现,斜带石斑鱼PKR与其他物种的PKR高度同源。通过构建原核表达载体PKR-p ET-32a,获得了斜带石斑鱼PKR的融合蛋白,经纯化后制备了斜带石斑鱼PKR鼠抗血清。利用荧光定量PCR对斜带石斑鱼PKR基因组织分布研究表明,该基因在所有检测组织中均有表达,其中肠的表达量最高,头肾次之。以荧光显微镜对其亚细胞定位进行了分析,该基因为全细胞分布,但主要分布于细胞质中。     

水稻OsBGAL1基因的亚细胞定位分析

植物β-半乳糖苷酶是一类与细胞壁重塑相关的糖苷水解酶,广泛分布于植物组织,参与多种生理生化过程,但水稻BGALs基因家族的亚细胞定位及其生物学功能尚不清楚。根据NCBI公布的水稻OsBGAL1的ORF序列设计引物,从日本晴叶片c DNA中扩增得到目的基因片段,构建了OsBGAL1-GFP融合表达载体,然后通过农杆菌介导的烟草瞬时表达系统对其进行亚细胞定位分析。激光共聚焦观察结果表明,与空载对照相比,水稻Os BGAL1蛋白主要定位于细胞壁,结合其生化活性,揭示其可能参与细胞壁多糖重塑。研究结果可为进一步研究其生物功能奠定基础。     

小鼠ZBTB9基因的克隆、亚细胞定位及原核表达

应用RT-PCR扩增技术从小鼠肺组织中成功克隆锌指蛋白ZBTB9基因;该基因含有1 380 bp的开放阅读框(ORF),编码459个氨基酸.为研究其生物学功能,构建pEGFP-C1/ZBTB9融合载体转染细胞,亚细胞定位显示ZBTB9定位于细胞核且呈斑点状分布.构建原核表达载体pGEX-4T-1/ZBTB9,转入大肠杆...     

水稻Ossp1基因的亚细胞定位及其干旱条件下的表达

sp1基因是叶绿体蛋白质输入调控的关键基因,本研究通过生物信息学分析、Real time PCR分析、瞬时表达分析等方法,对sp1在水稻中的同源基因Ossp1进行了结构和功能预测、组织表达和干旱响应性分析以及亚细胞定位分析。生物信息学分析结果显示,水稻Ossp1基因位于7号染色体,基因登录号为Os07g0647800,序列全长1 032 bp,SP1蛋白由343个氨基酸残基组成,信号肽序列位于氮端,蛋白质分子中有2个跨膜区域。Real time PCR分析结果显示,Ossp1在水稻叶片中表达量最高,其次为叶鞘,根中最低,此外,Ossp1在叶片中的表达具有明显的干旱响应性,受到干旱胁迫诱导后,表达量显著提高。采用瞬时表达进行亚细胞定位结果显示,SP1蛋白定位于水稻叶绿体。上述结果显示了Ossp1基因与水稻叶绿体及干旱胁迫响应的关系,为Ossp1基因功能的深入研究提供了基础。     

家蚕整合素基因Bmintegrin αPS3的鉴定及亚细胞定位

【目的】克隆家蚕整合素基因Bmintegrin αPS3,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征,并进行原核表达及蛋白纯化,为进一步探究Bmintegrin αPS3在家蚕中的功能奠定基础。【方法】利用RACE方法克隆获得Bmintegrin αPS3的cDNA全长序列;采用RT-PCR方法检测Bmintegrin αPS3的时空表达;在原核表达系统中表达获得Bmintegrin αPS3重组蛋白;并构建Bmintegrin αPS3真核表达载体,转染家蚕胚胎细胞系分析其蛋白亚细胞定位。【结果】家蚕整合素基因Bmintegrin αPS3 编码框全长为2 895 bp,编码965个氨基酸,含有整合素家族蛋白典型的integrin alpha结构域,预测其为跨膜蛋白。构建了Bmintegrin αPS3的原核表达系统,并利用亲和层析纯化获得高纯度的Bmintegrin αPS3原核表达蛋白,为进一步制备抗体获得足够的抗原。在家蚕细胞系中外源表达Bmintegrin αPS3蛋白,显示其主要定位于细胞质和细胞膜中。另外,RT-PCR结果显示Bmintegrin αPS3 mRNA 在血细胞中为特异持续表达。【结论】获得了Bmintegrin αPS3的完整cDNA序列及表达特征,经原核表达、纯化获得其融合蛋白,在细胞水平上初步分析了其亚细胞定位情况。     

野大麦耐盐适应性反应机制的研究

【目的】探讨野大麦的耐盐适应性反应机制。【方法】采用原子吸收和X-ray微区分析等方法分析野大麦[Hordeum brevisubulatum (Trin.) Link]在NaCl胁迫下幼苗生长、K+和Na+吸收、运输、分配及外排等生理响应。【结果】在NaCl≤350 mmol•L-1时，茎叶和根系的干重变化不明显，盐浓度的增加对根生长的抑制作用小于茎叶，根Na+含量增加的幅度小于茎叶、茎叶和根中K+含量均下降，但茎叶可维持较高的K+含量；野大麦具有较强的K+-Na+吸收选择性；低盐胁迫时Na+主要贮存于液泡和细胞间质；高盐胁迫时主要通过外排Na+来维持体内离子平衡。【结论】野大麦在NaCl≤350mmol•L-1时生长正常，其耐盐性与根拒绝吸收Na+及茎叶维持高K+含量有关，Na+区域化与外排可能是野大麦主要的耐盐适应性反应机制。     

野大麦种子萌发条件的研究

采用正交试验方法对松嫩平原野生野大麦种子在5个温度(15/25、20/30、15/30、20/25和15/20℃),5个梯度的Na2CO3浓度(0、20、30、40和50mmol·L-1)以及5个梯度的CS1菌浓度(OD值分别为0、0.5、0.05、0.005和0.0005)中的萌发特性进行了研究。结果表明,对发芽率、发芽势影响次序皆为温度Na2CO3浓度CS1菌浓度,对发芽指数影响次序为Na2CO3浓度温度CS1菌浓度,温度和Na2CO3浓度对发芽率、发芽势、发芽指数皆有显著影响(P0.05),而CS1菌浓度无影响(P0.05),且发芽率、发芽势、发芽指数皆随Na2CO3浓度升高而呈下降的趋势。野大麦种子发芽的最适条件为温度15/25、20/30和15/30℃,Na2CO3浓度为0mmol·L-1。     

不同条件下野大麦种子萌发特性研究

[目的]对松嫩平原野大麦种子在不同条件下的萌发特性进行研究,找出最佳的萌发条件。[方法]设定5个变温（15/25、20/30、15/30、20/25和15/20℃）,5个NaCl浓度（0、75、85、95和105mmol/L）,5个CS2菌浓度（OD值分别为0、0.5000、0.0500、0.0050和0.0005）,采用正交试验设计研究各因素对野大麦种子萌发的影响。[结果]温度和NaCl浓度对种子发芽率、发芽势和发芽指数皆有显著影响（P〈0.05）,而CS2菌浓度则影响不显著,并且发芽率、发芽势和发芽指数皆随NaCl浓度升高而呈下降的趋势。[结论]野大麦种子发芽的最适条件：温度为15/25和15/30℃,NaCl浓度为0mmol/L。     

野大麦幼根的愈伤组织诱导及植株再生

以野大麦（Hordeumbrevisubulatum（Trin．）Link）的幼根为外植体，采用MS培养基附加不同浓度的2，4－D诱导愈伤组织，结果以2，4－D4．0mg／L为最佳。以较低浓度2，4－D培养基进行愈伤组织的继代。在MS培养基附加2，4－D1．0mg／L＋6－BA0．1mg／L，以极低的频率分化出芽，再在附加IAA0．5mg／L＋6－BA2．0mg／L＋KT1．0mg／L＋Sucrose20g／L上的MS培养基上生根，最终再生成完整植株。     

短芒大麦DREB2基因的克隆及其转基因烟草的鉴定

以短芒大麦为材料,应用RT-PCR技术扩增获得792 bp的DREB2基因,构建了重组植物表达载体pBI-DREB2。通过农杆菌转化法将其导入烟草,并利用PCR、PCR-Southern和RT-PCR技术对获得的20株卡那霉素阳性转基因烟草进行分子鉴定。结果表明:短芒大麦DREB2基因已整合到烟草基因组中,并能在转录水平上表达。     

短芒大麦DREB1基因的克隆与特性分析

在已知短芒大麦DREB1基因3′端序列的前提下,根据其他植物中DREB1转录因子基因序列,首次克隆了短芒大麦全长DREB1基因(899 bp,具有1个编码220个氨基酸的完整阅读框)。序列分析和生物信息学分析表明,该基因具有转录因子的典型特征及AP2/EREBP结构域,并且具有6个丝氨酸、2个苏氨酸、2个酪氨酸磷酸化位点,这可能与翻译后在冷胁迫抗性中发挥作用有关。     

披碱草和野大麦及其杂种回交后代的农艺特性研究

为了使披碱草和野大麦的优良特性综合在一起,培育出适合干旱、盐渍生境的牧草新品种,王照兰等（1992—1993年）将披碱草和野大麦组合进行了远缘杂交,成功地获得了高度不育的披碱草和野大麦的正、反交F1代。在正交F1代（披碱草X野大麦）的植株形态学和细胞学初步研究的基础上,笔者拟定了用回交法克服杂种F1代不育性的研究计划。用分株繁殖方法,     

披碱草和野大麦及其杂种回交后代的农艺特性研究

[目的]探明BC1F3代对亲本(披碱草和野大麦)优良特性的继承情况、杂种优势及育性恢复情况。[方法]重点对披碱草和野大麦及其BC1F3代的农艺性状,包括生育期、生长速度、花粉育性、结实性、再生性和株丛鲜草产量等进行系统的比较研究。[结果]BC1F3代各株系的生长节律趋向于亲本野大麦,不同株系的生育天数有所不同,但都接近轮回亲本野大麦;BC1F3代不同株系花粉育性和结实性有较大差异,但回交后各株系的花粉育性和结实性都有一定程度的提高,YF3-93花粉育性已经超过亲本野大麦,自然结实率也较高。有的株系花粉育性和开放授粉结实率较低,如PF3-52。BC1F3代各株系产草量有较大变异,不同株系间存在明显的差异,如YF3-64、YF3-74和YF3-83的杂种优势分别为75.53%、75.12%和66.16%,而PF3-52、PF3-15、YF3-42产草量不及亲本。[结论]该研究为培育适合干旱、盐渍生境的牧草新品种提供了依据。     

野大麦盐胁迫rbcS基因的克隆及序列分析

[目的]对野大麦盐胁迫rbcS基因进行克隆及序列分析。[方法]以盐胁迫下的野大麦幼嫩叶片为试材,根据GenBank中小麦和大麦rbcS基因核酸序列的同源性设计引物,对野大麦基因组DNA进行PCR扩增、回收、连接、转化及测序。[结果]在野大麦的基因组中克隆了2个大小不同的rbcS基因序列rbcS1和rbcS2,长度分别为1252和908bp。rbcS1和rbcS2均由2个外显子和1个内含子组成,外显子长度相等,编码序列为525bp,同源性为96%,编码174个氨基酸;rbcS1和rbcS2内含子大小不同,分别为448和107bp。[结论]为进一步探讨rbcS基因在野大麦耐盐机制中的分子机制奠定了基础。