含双病原物诱导启动子植物安全表达载体的构建

 本研究用来自烟草的具有高度病原物特异性的两个诱导启动子EAS4和hsr203J,串联驱动GUS基因的表达,同时考虑到转基因植物的安全性,引入双边界序列,构建了含双病原物诱导启动子的植物安全表达载体。将表达载体转化烟草获得转基因植株。分析显示,在正常生长情况下转基因烟草检测不到GUS活性,或活性极低;而受疫霉激发子parasiticein、Phytophthora nicotianea[0]的孢子悬浮液和Ralstonia solanacarum的菌悬液诱导后,转基因烟草叶片中可检测到明显的GUS活性。结果表明,构建的植物表达载体所含双病原物诱导启动子均具有良好的诱导活性,可用于植物遗传转化。     

国槐凝集素基因的克隆及其功能

植物凝集素是一类能高度特异可逆结合到单糖或寡糖上的蛋白,含有至少一个非催化结构域,近年来在农作物抗虫工程中得到了广泛关注。本文从豆科植物国槐中克隆得到了一个新的凝集素基因SjLectin并初步研究了其对小菜蛾的抗性功能。从国槐幼叶中提取总RNA,采用RT-PCR法分离克隆出SjLectin基因的cDNA片段,该基因在GenBank中登录号为KC140286.1。SjLectin基因全长837 bp,编码279个氨基酸组成的蛋白。该蛋白与其他豆科凝集素的同源性均高达66%以上,属于豆科凝集素家族中的一员。在35S启动子控制下,利用根癌农杆菌介导法转化烟草品种W38,获得了该基因的抗卡那霉素植株。通过PCR和RT-PCR法筛选阳性转基因植株,证明SjLectin基因已经转化到烟草基因组中并在转录水平上得到了有效表达。接虫试验证明,阳性植株对小菜蛾的抑制率平均达62.2%。     

转基因水稻中β-1,3-葡聚糖酶基因启动子缺失体P3的激发子诱导活性

 选择合适的启动子是植物抗病基因工程的关键性因素,病原菌诱导型启动子的获得将为植物提供更多的启动子选择。将大麦β-1,3-葡聚糖酶同工酶GⅢ基因启动子的缺失体片段P3与报告基因gus (β-葡聚糖酸醛苷酶基因)偶联,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化水稻。PCR结果表明,所获得的10株潮霉素抗性水稻植株均呈PCR阳性;DNA印迹法结果显示,9株含P3/gus的融合基因已整合到水稻基因组DNA中。GUS组织化学染色及荧光法结果显示,P3缺失体驱动的gus在激发子诱导后,获得了高水平表达。T₁代种子的GUS组织化学染色结果也表明,激发子可以诱导高水平的P3活性。     

内质网应激因子NAC089突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应

 有研究表明烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)或黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)侵染烟草能够激活转录因子NbNAC089,从ER膜移至细胞核。为进一步阐释内质网应激因子NbNAC089对病毒侵染胁迫的响应机制,利用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体,经烟草遗传转染获得NbNAC089基因突变植株。植株接种病毒后采用qRT-PCR检测病毒CP基因和寄主UPR基因的表达。结果表明:CRISPR/Cas9系统定点敲除NbNAC089基因后,目的基因靶位点序列有碱基的置换与缺失。正常生长条件下,转基因植株与野生型无差异。植株接种TMV-GFP后24~96 h,突变体中UPR基因(BiP、bZIP28、bZIP60)的表达量显著高于野生型;接种TMV-GFP后2~6 d突变体中病毒的积累量和扩展速度显著高于野生型。表明NbNAC089为UPR的抑制因子,对病毒增殖具有负调控作用。     

心叶烟NPR1基因全长cDNA序列的克隆及表达分析

 NPR1(non-expressor of pathogenesis-related gene 1)基因在拟南芥系统获得抗性中起着关键作用,可调控拟南芥植株广谱抗性的发生。本文报道了从心叶烟中克隆NPR1同源基因(NgNPR1)及其表达特性的研究结果。NgNPR1 cDNA全长2253 bp,编码588个氨基酸。将NgNPR1基因组全长与cDNA序列进行比对发现,NgNPR1基因组DNA含有4个外显子和3个内含子。Southern杂交分析表明,在心叶烟基因组中NgNPR1为单拷贝基因。采用绿色荧光蛋白在洋葱表皮瞬时表达的试验,证明了NgNPR1蛋白在水杨酸诱导时会从细胞质转运到细胞核中。Northern杂交分析发现,NgNPR1基因可以被与植物抗病相关的信号分子如水杨酸、茉莉酸甲酯、过氧化氢和乙烯所诱导。进一步研究发现,植物病原物如赤星病菌、青枯病菌和烟草花叶病毒对心叶烟植株的侵染也会使NgNPR1表达量增加。这些结果表明,NgNPR1基因在心叶烟植株抵御病原物侵染过程中可能起着重要作用。     

马铃薯Y病毒CP基因5'端和3'端反向重复结构介导的抗病性研究

 本研究克隆了来源于马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)外壳蛋白(CP)基因(PVY^N CP)5'端和3'端的反向重复cDNA序列,并构建了植物表达载体pROKⅡ-5'IR和pROKⅡ-3'IR,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,分别获得166和126株转基因烟草。抗病性试验表明,转化PVY^N CP基因3'端茎50 bp(环50 bp) hpRNA(hairpin RNA)的烟草抗病率达69%,而转化PVY^N CP基因5'端相同片段长度的hpRNA的烟草却全部发病。Southern blot结果表明,转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;Northern blot结果表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果证明PVY^N CP基因的3'端比5'端更能有效地诱发基因沉默,并且hpRNA茎部的长度可减少到50 bp。该结果为探索利用CP基因的最短长度和有效部位的基因片段来培育多抗病毒转基因植物提供了依据。     

真核表达产物Y3诱导烟草对烟草花叶病毒的抗性研究

从毛头鬼伞Coprinus comatus中提取的碱性糖蛋白Y3可以降低烟草花叶病毒（TMV）的侵染。克隆获得Y3蛋白cDNA后与真核表达载体pPIC-9k连接,重组载体pPIC-9k-Y3成功电转化入毕赤酵母Pichia pastoris后,转化子在28℃、250 r/min培养条件下,使用1.0%甲醇诱导表达6 d,成功实现了Y3蛋白的真核表达。300 μg/mL浓度的Y3蛋白对普通烟进行诱导处理后摩擦接种TMV结果表明,诱导处理后烟草体内除过氧化物酶POD外,多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL和β-1,3葡聚糖酶活性都有不同程度提高。蛋白处理24 h后植株中PPO活性达到最大,为对照组的2倍。利用实时荧光定量PCR （qRT-PCR）研究抗性相关基因表达情况,Y3诱导后烟草植株碱性病程相关基因1（PR1-b）、病程相关基因非表达子1（NPR1）、PAL在转录水平上均显著上调（P<0.05）。推测真核表达产物Y3蛋白可通过提高水杨酸信号途径相关防御酶活性以及抗病基因转录来诱导烟草对TMV产生系统抗性,为Y3蛋白作为生物农药开发提供理论基础。     

dsRNA分解酶PAC 1对4种植物病毒、3种类病毒dsRNA的降解活性检测及转pac 1基因烟草的获得

 将来自粟酒裂殖酵母的pac 1基因,导入原核表达载体pET-5a中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导,其表达产物能够降解4种植物病毒Cucumber mosaic virus(CMV)、Tobacco mosaic virus(TMV)、Rice black-streaked dwarf(RBSDV)和Rice dwarf virus(RDV)和3种类病毒Apple scar skin viroid(ASSVd)、Coleus blumei viroid(CBVd)和Hopstunt viroid(HSVd)的dsRNA。将pac 1导入双元载体pBI121,并转入根癌农杆菌LBA4404,以烟草(品种NC89)组培苗的叶片为受体材料进行转化,经过诱导愈伤、分化、再生和筛选培养,获得了50株Kan抗性植株,收获T₁种子分别播种,对这些转基因植株进行分子生物学检测。PCR、PCR-Southern和RT-PCR检测结果表明,pac 1基因已整合到受体基因组中。     

马铃薯Y病毒HC-Pro、CI、NIb和CP基因介导的病毒抗性比较研究

 根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的基因组序列设计引物,利用PCR扩增HC-Pro、CI、NIb和CP4个基因的3'端400bp cDNA区段,分别反向插入含有査尔酮合成酶基因(Chalcone synthase,CHS)内含子的双元载体pRCHS中,构建了含内含子的发夹结构RNA (intron splicing hpRNA,ihpRNA)表达载体pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。病毒抗性检测的结果显示:转pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP的烟草中,抗性植株的比例分别为55.34%、73.69%、61.54%和84.21%。大分子RNA和siRNA的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关,转基因植株中可检测到siRNA,说明所获得的抗病性是RNA沉默介导的。     

苏云金芽胞杆菌谷氨酰胺合成酶基因glnA的转录调控和过表达

氮代谢对细菌生存至关重要,谷氨酰胺和谷氨酸盐在细菌氮代谢中发挥重要作用。本文对苏云金芽胞杆菌谷氨酰胺合成酶基因glnA的转录调控及过表达进行了研究。通过构建glnR基因的缺失突变株及glnA基因启动子融合lacZ基因的表达载体,测定突变株中glnA启动子活性,发现在胞外营养充足的情况下转录因子GlnR负调控glnA基因。同时在glnR基因苏云金芽胞杆菌缺失突变株中过表达glnA基因。发现与野生型相比,过表达菌株杀虫活性得到提高。     

十五种根结线虫病害的病原鉴定

 从全国的不同地区采集的15种植物根结线虫病的病原,按照国际根结线虫协作组综合鉴定方法,对每种病原进行了分类鉴定。其中,花生、葡萄、唐松草(均采自北京)根结线虫病的病原都属于北方根结线虫;月季根结线虫病的病原(北京)有一种是北方根结线虫,另一种是花生根结线虫2号小种;泡桐根结线虫病的病原(河南禹县)也属于花生根结线虫2号小种;烟草(河南郑州)、番茄(湖南长沙)、西瓜(湖南长沙)、白菜(江西南昌)、萝芙木(广西南宁)和栀子(广西南宁)根结线虫病的病原都属于南方根结线虫1号小种;在广西南宁采集的美登木根结线虫病病原有一种是南方根结线虫1号小种,另一种是爪哇根结线虫;黄瓜(北京)和柳树(广西桂林)根结线虫病的病原都属于爪哇根线虫;在广东海南岛采集的青皮象耳豆根结线虫病的病原是国际上没有报道过的新种,定名为象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)。     

我国主产区猕猴桃采后腐烂病病原多样性研究

猕猴桃采后腐烂在我国发生普遍.本试验对来自陕西、四川、湖北、山东和江西五省的773个猕猴桃病果进行组织分离,获得739个真菌分离株.经ITS序列比对及代表菌株的科赫式法则验证,确定其中722个菌株为猕猴桃采后腐烂病病原,属于以下11个属:Botryosphaeria、Diaporthe、Neofusicoccum、Al...     

RxLR效应因子Avr3a、Avr4和IPI-O在中国致病疫霉菌株中的组成

 由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯和番茄的晚疫病是一种世界范围内的重要病害。在致病疫霉与寄主的互作过程中,效应因子对于病原物能否成功入侵与定殖起到了关键作用。本研究检测了来自中国马铃薯主产区的37株致病疫霉菌中编码Avr3a, Avr4和IPI-O三种效应因子的基因组成,研究发现来自国内的所有供试菌株中只有1株分离自马铃薯的和2株分离自番茄的致病疫霉含有无毒基因Avr3a(编码Avr3a^KI),其余菌株均含有avr3a(编码Avr3a^EM);所有菌株中都仅含有编码截断蛋白的avr4;从37株国内菌株中共检测到了25种ipiO变异型,其中20种为新变异型,聚类分析的结果表明这些变异型仍属于已报道的三类ipiO,而且大部分ipiO变异型为无毒型,可以被抗性基因Rpi-blb1识别。该研究结果表明avr3a和avr4普遍存在于中国致病疫霉菌株中,推测大部分菌株可以克服R3a和R4抗性基因;而ipiO的无毒变异型仍然普遍存在于国内致病疫霉群体中,可以被马铃薯含有的抗性基因Rpi-blb1识别。     

中国-喜马拉雅区系中的一些真菌新种和新记录(续)

 本文系"中国-喜马拉雅区系中的一些真菌新种和新记录"(1979年)的继文,本期报导本区系中新种黄花木夏孢锈菌Uredo piptanthus sp.nov.和西藏柄锈菌Puccinia tibetica sp.nov.;高原特有种和古化石种中国鞘柄锈菌Coleopuccinia sinensis Pat.、日本明痂锈菌Hyalopsora japonia Diet.及珍贵树种、药用植物病原真菌Peridermium complanatum Berc.、乔松鞘锈菌Peridermium brevius Berc.、麻黄色被锈菌Peridermium ephedrae CKE当归柄锈菌Puccinia angilicae Fuck.、最后描述了我国西部地区重要病原-角落叶松锈菌Melampsora laricicaraearum Kleb.和木蓝锈菌Raveneia indigoferae Trans.。     

新疆博尔塔拉蒙古自治州草原蝗虫多样性及群落结构特征

2015―2018年,利用百网和“Z”形取样法系统调查了博尔塔拉蒙古自治州草原七个草地类型的蝗虫群落多样性,明确其蝗虫的群落结构特征和多样性组成。经过调查分类鉴定,确定博州草原蝗虫有 65种,隶属于5科30属,优势种为黑腿星翅蝗、黑条小车蝗和小米纹蝗。在博州,黑条小车蝗垂直海拔分布的范围最广（257～2382 m）,亚洲飞蝗和绿纹蝗垂直海拔的分布范围最为狭窄,仅为187～195 m;小翅曲背蝗和西伯利亚蝗多分布于高海拔地区（2000～2200 m）,红斑翅蝗则多分布于低海拔区域（750～1200 m）。温性荒漠的特有种为简蚍蝗、红翅瘤蝗和红斑翅蝗,低地草甸的特有种为亚洲飞蝗、小垫尖翅蝗和绿纹蝗。蝗虫群落的Shannon-Wiener多样性指数在温性荒漠、温性草原化荒漠和温性荒漠草原要显著高于低地草甸;Pielou均匀度指数和Simpson优势度指数在七个草地类型间无显著性差异。温性荒漠草原和温性草原的蝗虫群落最为相似,两者Jaccard相似系数为0.56。     

蔗糖水解酶注释基因XC0805与野油菜黄单胞菌8004菌株的蔗糖利用及致病相关

 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是造成十字花科植物减产的重要病原菌,其通过水孔或伤口进入植物体内并在维管束中快速繁殖。光合产物(蔗糖)的运输主要依靠植物维管组织,同时蔗糖也是维管组织重要的能量来源。本研究利用生物信息学和遗传学等方法对Xcc中参与蔗糖利用的基因进行了分析,并研究了这些基因与其致病力的关系。Xcc 8004菌株中注释的参与蔗糖分解蛋白的编码基因有XC1002、XC1642、 XC1645和XC0805。 XC1002和XC1642的编码产物属于糖苷水解酶GH97蛋白超家族,而XC1645和XC0805的编码产物则属于GH13家族。突变分析发现除XC0805外,其他3个都不影响Xcc的蔗糖利用能力。接种实验表明,XC0805参与Xcc的侵染或在植物体内的生长,其他3个不参与致病过程。另外,Xcc 8004中预测参与蔗糖转运的基因(XC0806和XC0807)突变并不影响细菌的蔗糖利用和致病力,表明其可能存在其他的蔗糖转运通路。上述结果说明XC0805可能是Xcc 8004主要的蔗糖水解酶基因,且在致病中起重要作用。     

蔗糖水解酶注释基因XC0805与野油菜黄单胞菌8004菌株的蔗糖利用及致病相关

 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是造成十字花科植物减产的重要病原菌,其通过水孔或伤口进入植物体内并在维管束中快速繁殖。光合产物(蔗糖)的运输主要依靠植物维管组织,同时蔗糖也是维管组织重要的能量来源。本研究利用生物信息学和遗传学等方法对Xcc中参与蔗糖利用的基因进行了分析,并研究了这些基因与其致病力的关系。Xcc 8004菌株中注释的参与蔗糖分解蛋白的编码基因有XC1002、XC1642、 XC1645和XC0805。 XC1002和XC1642的编码产物属于糖苷水解酶GH97蛋白超家族,而XC1645和XC0805的编码产物则属于GH13家族。突变分析发现除XC0805外,其他3个都不影响Xcc的蔗糖利用能力。接种实验表明,XC0805参与Xcc的侵染或在植物体内的生长,其他3个不参与致病过程。另外,Xcc 8004中预测参与蔗糖转运的基因(XC0806和XC0807)突变并不影响细菌的蔗糖利用和致病力,表明其可能存在其他的蔗糖转运通路。上述结果说明XC0805可能是Xcc 8004主要的蔗糖水解酶基因,且在致病中起重要作用。     

两种替代猎物对日本刀角瓢虫生长发育及生殖力的影响

为明确替代猎物对日本刀角瓢虫人工饲养的效果,以烟粉虱卵为对照,研究了地中海粉螟卵和米蛾卵对日本刀角瓢虫生长发育及繁殖力的影响。结果表明,饲喂米蛾卵的日本刀角瓢虫存活率为17.16%,发育历期显著延长,雌虫寿命显著缩短;饲喂地中海粉螟卵处理的存活率为77.82%,雌虫寿命显著延长。瓢虫幼虫期和成虫期营养对成虫产卵能力有明显影响:幼虫期饲喂地中海粉螟卵,成虫期分别饲喂米蛾卵和地中海粉螟卵,产卵量极显著降低(分别为64.45粒和53.82粒);幼虫期饲喂地中海粉螟卵,成虫期饲喂烟粉虱卵,产卵量(539.10粒)与对照组无显著差异;幼虫期饲喂烟粉虱卵,成虫期分别饲喂地中海粉螟卵和米蛾卵,产卵量极显著降低(分别为59.30粒和71.38粒)。因此,米蛾卵不适于日本刀角瓢虫饲养,地中海粉螟卵可作为瓢虫幼虫期饲养的替代猎物。     

大麦黄花叶病的研究

 大麦黄花叶病的病状是黄色花叶,有时叶片生短坏死条斑,植株矮缩。寄主仅大麦属(Hordeum spp.)8种。小麦属(Triticum spp.)17种,山羊草属(Aeoilops spp.)11种,黑麦(Secale cereal)和燕麦(Arena sativa)等40种禾本科植物不感染。     

假禾谷镰孢菌细胞自噬相关基因的鉴定与表达分析

细胞自噬是真核生物中一类包含多种进化保守的Atgs蛋白参与的蛋白质降解途径,该途径也参与多种植物病原真菌的产孢、孢子萌发和致病性过程。本研究利用模式物种已知的Atgs,通过生物信息学分析在假禾谷镰孢菌中鉴定到29个Atgs,分属29种不同蛋白类型。细胞自噬核心调控机制相关蛋白Atg1、Atg6、Atg8和Atg9的氨基酸序列系统进化分析结果显示,Atgs在丝状真菌间非常保守,符合物种进化的特点。通过假禾谷镰孢菌跟亲和与非亲和寄主转录组数据分析发现,与菌丝阶段相比26个Fp Atgs在侵染阶段的表达发生改变,其中Fp Atg1、2、3、4、5、7、8、9、13、22、23、28和Fp Vps34在侵染初期和中后期均诱导表达;Fp Atg6、14、17、20、24、29和Fp Vps15在侵染初期和中后期表达量均降低;Fp Atg10、11除在非亲和互作中后期表达量略有上调,其余阶段均显著下调表达;Fp Atg15、16在亲和互作初期诱导表达,其余阶段均下调表达;Fp Atg26、27在亲和互作初期下调表达,中后期诱导表达,而在非亲和互作初期表达量升高,到中后期下调表达。推测细胞自噬参与调控假禾谷镰孢菌的侵染过程。