烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清的制备

从山东省感病的烟草上分离获得了一烟草蚀纹病毒(TEV)分离物,命名为TEV-SD1.根据已报道烟草蚀纹病毒外壳蛋白(coat protein CP)基因序列设计并合成2条引物,通过RT-PCR扩增得到长度约800bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b( )连接,构建了包含TEV CP基因的原核表达载体pETEV-CP,并导入大肠杆菌BL21中.序列分析表明:TEV-SD1的CP基因全长789bp,编码263个氨基酸;与GenBank中已报道的TEV 5个分离物CP基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为94.1%～98.6%.37℃培养条件下,BL21/pETEV-CP经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示,表达的TEV CP融合蛋白的相对分子质量约为33 kDa.以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备的抗血清的效价为1/2048,且具有良好的特异性.     

苹果茎沟病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清制备

利用原核系统表达病毒编码的结构蛋白为抗原制备多克隆抗体是提高检测灵敏度和降低检测成本的重要途径。根据已报道的苹果茎沟病毒Apple stem grooving virus(ASGV)外壳蛋白(coatprotein,CP)基因的核苷酸序列设计合成引物,利用RT-PCR方法克隆了ASGV的cp基因(命名为ASGV cp BJ),该基因由714个核苷酸组成,与GenBank中已报道的ASGV的cp基因核苷酸相似性为86%~96%。将ASGV的cp基因克隆到原核表达载体pET-28a上,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选得到阳性克隆pET-ASGVcp。SDS-PAGE电泳分析发现,经IPTG诱导,ASGVcp在大肠杆菌中得到高效表达,获得的融合蛋白的分子量约为33kD。利用Ni珠吸附法纯化原核表达的目的蛋白,并以此蛋白为抗原制备了抗血清,ACP-ELISA检测结果显示,此抗血清效价为1∶4 096。Western blot分析结果显示,该抗血清具有高度特异性,能够用于ASGV的快速检测。     

桑脉带相关病毒N蛋白多克隆抗体的制备

 桑脉带相关病毒(Mulberry vein banding associated virus,MVBaV)属于番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的新成员,是广西桑树病毒病的主要病原病毒。本研究将MVBaV核外壳蛋白(nucleocapsid protein, N protein)基因连接到pET-30a原核表达载体上,获得重组表达载体pET-30a-MVBaV-N并转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经IPTG诱导可表达产生一个含His标签、分子量约36.0 kDa的融合蛋白。用 Ni^{2 +} -NTA树脂纯化融合蛋白,将其免疫日本大耳兔制备多克隆抗体。间接ELISA测定抗体的效价为1∶256 000。Western blot 检测结果显示,该多克隆抗体在稀释倍数1∶1 000时与细菌表达的融合N蛋白及感病桑叶中的N蛋白产生特异性识别,但不与寄主蛋白产生交叉反应,表明具有良好的特异性和较高的灵敏度。将抗体按1∶2 500稀释后进行间接ELISA,可有效检出桑叶中的MVBaV。MVBaV N蛋白抗体的成功研制,为桑脉带病毒病的诊断及MVBaV与寄主相互作用机制的研究提供了重要的试剂。     

侵染猕猴桃的柑橘叶斑驳病毒外壳蛋白多克隆抗体的制备及检测应用

 柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus, CLBV)是β线形病毒科(Betaflexiviridae)柑橘病毒属(Citrivirus)的代表种,前期研究表明CLBV在陕西栽培猕猴桃中广泛发生。为进一步简化CLBV的检测,并探究其致病机制,通过RT-PCR扩增得到CLBV猕猴桃分离物外壳蛋白(coat protein,cp)基因,将其插入原核表达载体pET-30a (+),导入E. coli BL21 (DE3)感受态细胞,成功表达出约59 kDa的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白对大白兔进行皮下多点免疫注射,获得的抗血清经纯化浓缩后,最终得到浓度为3.78 mg·mL^-1的多克隆抗体。将抗体1∶1 000稀释后可检测500 pg抗原,使用Dot-ELISA可直接检测田间猕猴桃样品。多克隆抗体的制备为CLBV的检测提供了便捷,也是后续研究CLBV致病机理的重要工具。     

百合斑驳病毒CP与CI基因的融合表达、多抗制备及其应用

采用RT-PCR方法从甘肃地区引种的切花百合上克隆了百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的外壳蛋白(coatprotein,CP)基因与细胞质内含体(cytoplasmic inclusions,CI)基因的3′端600 bp片段,连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了融合表达的重组质粒pET-28a-CP-CI200。重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋白CP-CI200。经镍柱亲和层析获得纯化的融合蛋白,进一步用其免疫家兔制备了多克隆抗体。Western Blot结果显示,该多抗与感染LMoV的百合叶片中的病毒CP与CI均发生特异性反应,而对健康百合叶片无反应。用该多抗建立双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测百合叶片样品,相对于RT-PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93.3%。研究结果为快速、准确检测百合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础。     

百合斑驳病毒CP与Cl基因的融合表达、多抗制备及其应用

采用RT-PCR方法从甘肃地区引种的切花百合上克隆了百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因与细胞质内含体(cytoplasmic inclusions,Cl)基因的3'端600 bp片段,连接到原核表达载体pET-28a(+)上.构建了融合表达的重组质粒pET-28a-CP-CL200.重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋白CP-C1200.经镍柱亲和层析获得纯化的融合蛋白,进一步用其免疫家兔制备了多克隆抗体.Western Blot结果显示,该多抗与感染LMoV的百合叶片中的病毒CP与CI均发生特异性反应,而对健康百合叶片无反应.用该多抗建立双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测百合叶片样品,相对于RT-PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93.3%.研究结果为快速、准确检测百合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础.     

百合斑驳病毒外壳蛋白基因原核表达、抗血清制备及其应用

为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMoV的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,然后连接到原核表达载体pET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)并诱导表达,以表达的重组蛋白为抗原制备该病毒的抗血清。结果显示:LMoVCP全长为822 bp,编码274个氨基酸;SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,经IPTG诱导得到了分子量约为34 kD带有HIS标签的目的蛋白;用该蛋白制备的抗血清经间接ELISA和Western blot检测结果显示,其效价为1∶51 200,具有较高的特异性,可用于感染LMoV百合的检测,其检测结果与RT-PCR检测结果一致。     

草莓镶脉病毒外壳蛋白抗原表位预测、克隆、表达及鉴定

为实现草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的简单和快速检测,应用生物信息学方法分析了SVBV外壳蛋白的线性抗原表位及其理化性质,以大肠杆菌的优势密码子对所预测的优势抗表原位进行设计并合成,同时进行了最佳异源表达条件优化。结果表明,第218~238位的氨基酸残基序列为SVBV外壳蛋白的优势抗原表位,其编码片段为5-AE。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测结果表明,重组融合蛋白的分子量约为24.8 kD,与其理论分子量20.5 kD基本一致。异源表达优化的结果表明,当IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度为40℃、诱导时间为4 h时,重组融合蛋白的表达量最高,为23.6 mg/L。Western blot结果表明重组融合蛋白能与His多克隆抗体起特异性反应。串联质谱结果表明,5-AE肽段氨基酸残基序列正确。     

蜡样芽孢杆菌M22Fe-SOD基因克隆及其分析

 通过筛选蜡样芽孢杆菌M 22基因组文库, 得到约3.9 kb的基因组片段。BLAST结果显示:其中包含1条长度为915 bp、编码304个氨基酸的超氧化物歧化酶(SOD)基因, 其与Bacillus thuringiensis和Bacillus anthracis中的sodF基因同源性高达95%。此sodF基因能互补恢复大肠杆菌SOD缺陷型菌株QC871在10 μmol/L paraquat中的生长能力。对重组表达蛋白的抑制实验表明, 此SOD基因为Fe-SOD。利用pET-30b (+)构建表达载体pET-sodF并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经IPTG诱导后, SOD融合蛋白表达量显著增加。构建自杀载体p299-8, 同源重组突变蜡样芽孢杆菌M22 sodF基因后, 突变体抗氧化能力未显著降低。     

甘蔗黄叶病毒运动蛋白的原核表达和抗血清制备

 甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)属于黄症病毒科(Luteoviridae)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),主要由蚜虫传播,能够侵染甘蔗、玉米等多种作物,引发严重的植物病害。本研究将编码ScYLV运动蛋白(Movement protein,MP)的基因连接到pDB-His-MBP原核表达载体上,转化到大肠杆菌菌株Rosetta中,经IPTG诱导,表达分子量大小约为70 kDa的融合蛋白,将纯化后的融合蛋白制备多克隆抗血清。利用western blot检测抗血清的效价为1:128 000,灵敏度为1:256,抗血清不与马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的其它病毒以及黄症病毒属(Luteovirus)病毒发生交叉反应,具有很好的特异性。本文制备的ScYLV MP抗血清可以用于ScYLV的检测,并为深入研究ScYLV与寄主的相互作用等问题提供材料基础。     

烟草脉带花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

 利用马铃薯Y病毒属病毒的简并引物, 通过RT-PCR技术获得了云南烟草病毒分离物YND的3'端约1.7 kb片段, 序列分析证明该分离物为烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)。将TVBMVcp基因克隆到表达载体pET-22b (+)上, 在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子量为35.0 kD的融合蛋白。利用该融合蛋白制备了TVBMV的多克隆抗体, ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting和DIBA分析结果表明, 获得的抗血清和原核表达的病毒蛋白及植物病汁液中的病毒均有特异性反应, 可用于TVBMV的快速检测。     

白草花叶病毒CP基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 将白草花叶病毒(Pennisetum mosaic virus,PenMV)的外壳蛋白(CP)基因连接到表达载体pET22b (+)上,获得重组子pET-PCP。SDS-PAGE和Western blotting分析表明,经IPTG诱导后,含pET-PCP的大肠杆菌BL21(DE3) pLys产生分子量为36 kDa的融合蛋白。以Ni²⁺亲和层析柱纯化该蛋白,并以其为抗原免疫德国大白兔制备了特异性较强的抗血清。微量免疫沉淀法测其效价为1:1 024,酶联法(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)测定的效价为1:8 192。该血清可替代常规病毒粒子所制备的抗血清,用于检测PenMV。     

西瓜花叶病毒抗血清制备及其应用

 西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)是危害葫芦科作物的重要病毒。制备特异性强、效价高的抗血清对快速准确检测和鉴定WMV具有重要意义。本研究将WMV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV获得pEHISTEV-WMV-CP。将pEHISTEV-WMV-CP转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,成功表达出分子量约为36 kDa的蛋白,与预期WMV CP大小一致。切胶回收WMV CP,与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后免疫健康新西兰大白兔。Western blotting结果表明,制备的抗血清与WMV CP有反应,与同属的番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)和烟草花叶病毒属的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)均无反应。酶联免疫吸附测定(PTA-ELISA)结果表明,本研究制备的WMV抗血清效价为1∶8 192,并且能够检测稀释512倍的病毒汁液。利用该抗血清对田间采集的10个RT-PCR检测为阳性的样品进行检测,全部呈现阳性。本研究利用大肠杆菌表达的CP制备的WMV抗血清具有较高的特异性和灵敏度。研究结果为WMV的快速检测和鉴定奠定了基础。     

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因的构建

 以番木瓜环斑病毒黄斑分离物(PRV-YS) RNA为模板,在人工合成的两端引物引导下,反转录合成了外壳蛋白(CP)基因cDNA第一链并通过PCR扩增获得双链cDNA。用重组有cDNA的pUC19转化E.coli DH52,采用双脱氧链终止法进行了cDNA序列分析,结果表明CP基因为861nt,与文献^[1]报道的相比,同源率90%,且少连续的6nt。     

大麦条纹花叶病毒中国株CP基因克隆分析、原核表达及抗血清制备

 首次用PCR方法,自大麦条纹花叶病毒中国株(BSMV-CH)的RNA₂(GenBank登录号为:AY789694,未报道)中扩增出外壳蛋白(coat protein,CP)基因,并亚克隆到pMD18-T载体上进行测序分析。结果表明BSMV-CH的CP全长597bp,它与BSMV其它株系CP的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为93.1%~93.8%和91.4%~92.4%;与同属的早熟禾半潜病毒(PSLV)和剪秋罗环斑病毒(LRSV)的核苷酸同源性分别为53.0%和41.8%,氨基酸同源性分别为48.1%和40.0%。根据大麦病毒属病毒已经报道的CP氨基酸序列绘制系统发育树,分析表明分离的各毒株在进化上存在明显地理位置的相关性。把CP基因亚克隆到GST融合表达载体pEGX-6p-1上,优化IPTG诱导终浓度后,在37℃ IPTG终浓度为1.0mmol/L时,融合蛋白GST-CP在大肠杆菌BL21中得到了特异表达。12% SDS-PAGE表明,表达产物大小为48.5kDa,主要以包含体形式存在。对蛋白进行定量后,用冰冷的KCl显色,分离表达的蛋白质特异条带制备抗原,免疫家兔得到抗血清,酶联法(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)测定的抗血清效价为1/6 400。用抗血清对感病大麦和健康大麦进行检测,结果表明抗血清有很高特异性。     

辣椒轻斑驳病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)属于烟草花叶病毒属,是辣椒的重要病毒种类之一。将PMMoV的外壳蛋白(cp)基因克隆至原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组PMMoV CP蛋白以可溶形式表达,纯化后获得分子量约35 kDa的融合CP蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备了PMMoV CP特异性抗血清。Western blot检测结果表明该抗血清与重组CP蛋白发生强烈的免疫反应,间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)结果显示该抗血清针对重组CP蛋白的效价达1∶25 600,针对PMMoV病汁液的效价达1∶4 000,检测灵敏度为1∶3 200,且该抗血清不与PMMoV同属或不同属的其它6种病毒汁液发生免疫反应,具有较好的特异性。利用该抗血清对42份田间辣椒病样进行检测,阳性率达38%,与进口商品化试剂盒检测结果一致,说明该抗血清可用于PMMoV的ELISA诊断。     

GFP与水稻条纹病毒病害特异蛋白的融合基因在sf9昆虫细胞中的表达

 用重叠延伸PCR(overlap Polymerase Chain Reaction,overlap-PCR)方法获得了含有绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)和水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)病害特异性蛋白SP(Disease-specific protein)两者的融合基因(GFP-SP),并将其克隆至载体pMD18-T,得到的重组质粒pMD18-T-GFP-SP经Xba Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切后与经相同方法处理过的杆状病毒转移载体pFastBacHTb相连接构建成重组转移质粒pFastBacHTb-GFP-SP。酶切和测序鉴定证明了其序列的正确性并且无移码现象发生。将此质粒转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,得到含有目的基因片段的重组杆状病毒穿梭质粒rb-GFP-SP。以之转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda,sf9)细胞,24~48h后在显微镜200倍可见光视野下观察到被感染细胞发生了细胞和细胞核变大、细胞内颗粒物增多、细胞脱落甚至裂解等一系列与正常的st9昆虫细胞形态有明显区别的变化。荧光显微镜下可见部分细胞发出清晰的绿色荧光,且大部分荧光集中在细胞质部分。这些结果表明,GFP-SP融合蛋白在st9昆虫细胞内成功表达。