志贺样毒素Ⅱ型变异体对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌IL-8 IL-6和PGI2的影响

志贺样毒素Ⅱ型变异体[1](SLT-Ⅱe)是猪水肿病大肠杆菌导致仔猪形成水肿病的主要致病因子.研究证明,SLT-Ⅱe能损伤小肠上皮细胞和血管内皮细胞[2],引起细胞分泌功能障碍,进而导致微血管舒缩和通透性发生变化,最终形成猪水肿病.本试验通过研究SLT-Ⅱe作用大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(MVECs)后,其培养上清液中IL-8、IL-6和PGI2的浓度变化,以期从SLT-Ⅱe影响微血管内皮细胞分泌功能方面,探讨SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜MVECs的损伤机制.     

猪水肿病大肠杆菌基因突变株的构建

应用定点突变技术将野生型猪水肿病大肠杆菌(O_(139))主要毒力基因SLT-Ⅱe A亚基中第167位谷氨酸和第170位精氨酸,分别突变为谷氨酰胺(E1670)和亮氨酸(R170L)后,获得突变基因SLT-Ⅱe~*。通过同源重组,将野生菌中的毒力基因SLT-Ⅱe替换为SLT-Ⅱe~*,构建了一株毒力基因突变株(SLT-Ⅱe~*)。实验结果显示,该突变菌株对Vero细胞的毒性是野生菌毒性的1/500。     

志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚基单克隆抗体的制备

为建立针对仔猪水肿痛SLT-Ⅱe毒素的检测方法,应用PCR技术克隆SLT-Ⅱe B基因,并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达.以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术获得6株稳定分泌抗SLT-Ⅱe B的单克隆抗体(McAb)细胞株,其抗体亚类包括IgM、IgA、IgG2b和IgG2a,而且轻链均为K链.阻断ELISA结果显示,6株McAb均能特异性识别天然SLT-Ⅱe毒素.相加ELISA结果显示,3G7和4F3两株是针对不同抗原表位的McAb.     

氧化苦参碱对SLT-2e作用下肠黏膜微血管内皮细胞分泌IL-8的影响

猪水肿病又称肠毒血症,是由某些O抗原型大肠杆菌引起的猪的致死性、细菌性传染病[1].1950年,Timoney F[2]等研究证实,猪水肿病的主要致病因子是志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-2e).     

一株混合O血清型猪水肿病大肠杆菌的分离与鉴定

从具有典型临床症状和病理剖检变化的病死猪肠系膜淋巴结中分离到的1株革兰阴性细菌,通过菌体形态观察,染色、生化试验、SLT-Ⅱ e基因检测、O血清型鉴定、动物试验,其结果证明分离菌为O26、O139、O142混合血清型,产SLT-Ⅱ e大肠埃希氏杆菌.SLT-Ⅱ e基因序列与GenBank上发表的参考序列(序列号为AY368993)的同源性达100%.用粗提的毒素经腹腔注射小鼠后引起小鼠后肢麻痹、死亡和胃肠水肿.     

SLT-Ⅱe对PIMVECs分泌炎症反应相关细胞因子的影响

本试验旨在探究大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）处理后,猪小肠微血管内皮细胞（PIMVECs）分泌的肿瘤坏死因子α（TNF-ɑ）、P选择素（P-selectin）、一氧化氮（NO）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）和内皮素（ET）水平的变化。采用超速离心法提取SLT-Ⅱe,采用BCA试剂盒测定其质量浓度,使用SDS-PAGE及Western blotting验证蛋白纯度;用WST-1法从0.1、0.5、1、5、10 μg/mL SLT-Ⅱe和0、2、4、8、12、24 h中筛选出SLT-Ⅱe对PIMVECs最佳作用浓度与时间;ELISA法检测对照组（0 μg/mL SLT-Ⅱe）和试验组（1 μg/mL SLT-Ⅱe）细胞上清中TNF-ɑ、P-selectin、NO、ICAM-1和ET含量的变化。结果表明：所提蛋白为SLT-Ⅱe,蛋白含量为721.75 μg/mL;1 μg/mL的SLT-Ⅱe作用8 h后可极显著降低PIMVECs的活性（P<0.01）;1 μg/mL的SLT-Ⅱe作用9和12 h时PIMVECs的TNF-ɑ分泌量显著升高（P<0.05）,NO/ET的值显著高于对照组（P<0.05）,作用6、9、12 h时P-selectin的含量显著升高（P<0.05）,作用12 h时的ICAM-1分泌量显著升高（P<0.05）。综上所述,SLT-Ⅱe浓度为1 μg/mL时可以诱导PIMVECs分泌的TNF-ɑ、P-selectin、ICAM-1以及NO/ET上升,为研究仔猪水肿病发病机制提供参考。     

猪水肿病的成因及发病机制

猪水肿病(ED)由肠毒血症大肠杆菌(ETEEC)引起.在母源抗体IgA下降、饲料中蛋白质含量过高、缺硒和过食等诱因的刺激下,猪肠道内大肠杆菌迅速繁殖,依靠定植因子粘附到肠粘膜细胞上,并产生SLT-Ⅱe毒素.SLT-Ⅱe是一种热不稳定蛋白质,它能与血管内皮细胞和平滑肌细胞上的受体结合,阻碍细胞内蛋白质合成,造成血管损害而致水肿.     

SLT-2e对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌PGI2、TXA2和PAF的影响

志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-2e)又叫猪水肿病毒素,能引起仔猪水肿病,是仔猪水肿病的主要毒力因子[1~3]。SLT-2e作用于微血管能引起微血管内皮细胞损害而导致水肿,因此在猪水肿病的发生中起着决定性作用。M eth iyapun等[4]研究表明水肿病大肠杆菌对猪肠黏膜没有重要的病理变化,而靶细胞是微血管内皮细胞,表现为内皮细胞空泡化、血管周围水肿、微血栓形成等。为了研究微血管内皮细胞在仔猪水肿病发病机制中的作用,本试验应用原代培养的肠黏膜微血管内皮细胞研究了SLT-2e对其培养上清液中PG I2、TXA 2及PDF浓度的影响,旨在了解SLT-2e…     

猪水肿病发病机理研究进展

猪水肿病主要发生于断奶后2周内的仔猪,是常见的一种急性致死性传染病。该病是由利用其菌毛(F18ab)黏附于小肠上皮细胞,并产生类志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)的产类志贺毒素大肠埃希菌引起的一种肠毒血症。仔猪断奶后的免疫能力,营养水平和遗传抗性是导致猪水肿病的主要影响因素。文章着重阐述了猪水肿病的致病机理,为该病的预防和治疗提供重要的理论依据。     

茯苓酸对SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的影响

通过检测茯苓酸对SLT-Ⅱe诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的浓度变化,探索茯苓主要成分茯苓酸对仔猪水肿病的疗效机制.将培养的肠黏膜微血管内皮细胞分为对照组、SLT-Ⅱ e组、不同质量浓度茯苓酸处理组5个组,采用ELISA法测定了培养3,6,9,12 h细胞上清液中P-选凝素、sICAM-1及TNF-α浓度的变化.结果表明,不同质量浓度茯苓酸处理组对SLT-Ⅱ e诱导肠黏膜微血管内皮细胞过量分泌P-选凝素、TNF-α无明显的抑制作用;0 mg/L茯苓酸处理组对SLT-Ⅱ e诱导肠黏膜微血管内皮细胞sICAM-1的分泌具有明显的下调作用,使其分泌sICAM-1的浓度逐渐下降至正常水平.由此可见,茯苓酸通过抑制SLT-Ⅱ e诱导肠黏膜微血管内皮细胞sICAM-1的过量分泌,阻止白细胞与内皮细胞之间的牢固黏附,防止过度炎症反应对机体的损害,以达到治疗疾病的目的.茯苓酸保护大鼠肠黏膜微血管内皮细胞损伤的模型剂量为10 mg/L.