鸡γ-干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗NDV活性

将鸡γ-干扰素(chIFN-γ)基因先克隆,接着通过大肠杆菌表达后进行产物纯化与活性检测.通过PCR方法以带有信号肽的重组质粒PMD-18T-preIFN-γ为模板,扩增无信号肤chIFN-γ基因片段,克隆至原核表达载体pProEXTM HTa,构建重组表达质粒pProEXTM HTa-chIFN-γ,在大肠杆菌BL2...     

猪肌生成抑制素功能区编码基因的原核表达与纯化

根据猪肌生成抑制素基因设计1对引物,PCR扩增出猪肌生成抑制素功能区编码基因片段,将该片段克隆至pGEM-T载体中。重组克隆质粒经序列分析,克隆序列与目的基因序列完全一致。重组克隆质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,目的基因片段克隆到表达质粒径pGEX-4T-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的18%以上。     

猪链球菌2型epf基因的原核表达及其蛋白纯化

为了克隆、表达SS2菌株轲基因片段,分析蛋白活性,根据GenBank SS2 epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf,在大肠杆菌中诱导带有GST标签的融合蛋白rEF-GST的表达;亲和层析法纯化融合蛋白rEF-GST,用凝血酶切除重组蛋白中的GST,获得纯化的EF抗原。经Westernblot鉴定,EF可与SS2多克隆抗血清发生特异性反应。     

斑马鱼一种母源凝集素基因zfol的原核表达和抗体制备分析

zfol是斑马鱼的一种母源凝集素基因。从斑马鱼胚胎中提取RNA,应用RT-PCR从斑马鱼中得到zfol的基因片段,重组入原核表达载体pEASY-E2中得到重组质粒,并测序鉴定其序列的正确性,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中诱导表达,并纯化蛋白,利用纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子,制备斑马鱼母源凝集素Zfol蛋白的多克隆抗体,利用Western-blot方法检测抗体特异性,得到特异的多克隆抗体,为进一步研究母源凝集素基因zfol的功能奠定了基础。     

猪TTV2 ORF1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了构建猪输血传播病毒2型(TTV2)ORF1基因部分片段的原核表达载体,进行原核表达,并利用重组蛋白质制备猪TTV2的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出猪TTV2 ORF1基因的部分片段,将其克隆至原核表达载体pcoldI中,构建原核表达质粒pcold-g1,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。表达产物通过镍离子亲和层析柱进行纯化,用Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白质免疫新西兰大白兔制备猪TTV2多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性,间接ELISA检测抗体效价。PCR扩增获得大小为1 227 bp的片段,重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;重组蛋白质分子量为5.2×104,主要以包涵体形式存在,纯化后纯度可达95%以上,具有较好的抗原性;制备的多克隆抗体特异性高,抗体效价达1∶12 800。重组蛋白质在大肠杆菌中得到了高效表达,为建立TTV2间接ELISA检测方法提供了优质的包被抗原。     

盐生植物盐穗木HcPS_H基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体。[方法]以质粒pGEM-T-HcPS_H为模板,HcPS_H-pET28a-F、HcPS_H-pET28a-R为引物进行PCR扩增,获得两端含酶切位点的HcPS_H基因目的片段。将该目的片段与大肠杆菌表达载体pET-28a通过T4DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到重组子克隆,抽质粒进行测序鉴定。[结果]扩增出HcPS_H基因片段长度为441 bp,将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上后,得到重组子质粒,经PCR检测、双酶切验证及测序鉴定,表明成功构建原核表达载体。[结论]该研究成功构建了盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体,为进一步进行该基因功能的研究奠定了基础。     

牛结核杆菌mpb-83基因的扩增和表达

采用PCR方法扩增牛结核杆菌mpb-83基因,并将其连接到T3克隆载体,然后克隆到原核表达载体PET-32a中,构建重组质粒PET-32a—mpb-83。以重组质粒转化大肠杆菌BL21,用NI柱纯化,最后纯化产物在SDS—PAGE中检测。结果得到约664bp的目的片段,且MPB-83可在大肠杆菌BL21中高效表达。     

phyA基因在毕赤酵母中的表达以及表达产物的检测

对获得的植酸酶基因PhyA进行TA克隆,获质粒pTA-phyA,酶切后,使其在连接体系中连接到酵母表达载体pPIC9K-InS片段上,随后将重组质粒转化给大肠杆菌,验证其成功后,再将重组质粒转化给毕赤酵母,诱导其表达,通过测定植酸酶活性,得出其表达量。     

TGEV与PEDV核衣壳蛋白双价基因原核质粒的构建与表达

运用DNA重组技术将猪传染性胃肠炎病毒核衣壳基因、猪流行性腹泻病毒核衣壳基因编码最大局部亲水性抗原决定簇基因片段进行串联,克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建预防仔猪冠状病毒性腹泻双价基因原核表达质粒.将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳结果显示,双价重组基因表达...     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达

为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗

【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达PCV2b亚型ORF2基因,利用重组Cap蛋白制备PCV2 VLP疫苗的可行性。【方法】 根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2 NJ株ORF2基因,将其插入原核表达载体pQZ1,鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21,利用原核表达平台CVC1102对重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析;利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装;利用BCA试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量,利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比,得出目的蛋白量,将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg·mL^-1。使用不同剂量的重组蛋白与206佐剂乳化,免疫2-3周龄抗原抗体双阴性的仔猪,同时设含免疫增强剂CVC1301、CVC1302的试验组、同类制品免疫对照组与空白对照组,免疫后14 d与21 d所有试验猪采血,分离血清,利用武汉科前生物科技有限公司的猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒检测试验猪血清中PCV2抗体水平;免疫后28 d试验猪按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2攻毒程序,利用PCV2 NJ株F₆代进行强毒攻击试验,肌肉注射与口服PCV2 NJ株各10^5.0TCID₅₀,同时利用乳化的钥匙孔血蓝蛋白及硫酸巯基乙醇培养基进行免疫刺激,攻毒后25 d,对所有试验猪进行解剖检测,通过攻毒过程中试验猪体温变化、试验猪平均相对日增重、解剖时试验猪肺部与相关淋巴结的大体变化及攻毒后PCV2核酸检测等4个方面评价大肠杆菌表达制备的PCV2 VLP的免疫效力。【结果】SDS-PAGE结果表明PCV2 NJ株优化的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中;Western blotting分析结果显示表达的重组Cap蛋白能够与PCV2阳性血清发生反应;电镜下观察可见大量直径在17 nm左右的PCV2病毒样颗粒存在于超声破碎后的上清中;500 μg/头重组VLP疫苗免疫猪产生较高的抗体水平,单次免疫后21 d抗体100%达到合格,对PCV2强毒的攻击提供完全保护。【结论】实现了PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达,重组Cap蛋白体外自我组装成病毒样颗粒,且具有良好的免疫原性,可用于制备PCV2亚单位疫苗。     

牛病毒性腹泻黏膜病毒E2基因的原核表达与免疫原性分析

[目的]原核表达牛病毒性腹泻黏膜病毒(BVDV)E2基因编码蛋白。[方法]采用PCR方法从BVDV中扩增E2基因片段,与原核表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒pET-32a-E2,转化E.coli(Rosetta)感受态细胞,重组菌用1 mmol/L IPTG诱导表达E2蛋白,进行SDS-PAGE电泳,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,经Western blot分析鉴定免疫原性。[结果]重组质粒pET-32aE2经PCR及酶切鉴定证明构建正确,重组质粒能够在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为58 kDa,纯化后E2重组蛋白浓度0.521 mg/mL,Western blot分析表明,其能被BVDV阳性血清识别,具有很好的免疫原性。[结论]E2蛋白成功表达,为后续建立BVDV检测方法奠定了基础。     

PCV-2陕西株ORF2基因的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆猪圆环病毒2型陕西分离株(PCV-2SX株)ORF2基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的PCV-2ORF2基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,应用PCR方法扩增PCV-2SX株ORF2全长基因,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。然后,将ORF2基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。【结果】扩增到了702bp的PCV-2ORF2全长基因。序列分析结果表明,PCV-2SX株ORF2基因与广西分离株(EF675237,ChinaGX)和巴西分离株(DQ861802,am21)的核苷酸序列同源性均达98.0%,氨基酸序列同源性均达98.3%,与其他毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在89.9%～97.9%和88.5%～98.0%。SDS-PAGE可检测到分子质量约为48ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。Western-blotting分析表明,重组蛋白可被PCV-2阳性血清所识别。【结论】成功克隆了PCV-2SX株ORF2基因,并进行了原核表达。     

鸭β-防御素2基因的克隆、表达和表达产物的生物学特性分析

 【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素（AvBD）2基因,在大肠杆菌中高效表达,检测重组鸭AvBD2蛋白的生物学特性。【方法】应用RT-PCR技术从鸭胰腺组织中扩增鸭AvBD2基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-2的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性。【结果】鸭胰腺组织中克隆出鸭AvBD2基因的cDNA大小为195 bp,编码64个氨基酸。同源性分析表明,鸭AvBD2与其它物种AvBD2同源性较高。凝胶电泳结果显示重组鸭AvBD2蛋白在原核高效表达（分子量约为32 kD）,对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌有较高抗菌活性,对大肠杆菌与猪霍乱沙门氏菌的抗菌活性较弱。重组鸭AvBD2蛋白对上述细菌的最小抑菌浓度为15.25～125 μg?ml-1,对猪霍乱沙门氏菌最小抑菌浓度大于400 μg?ml-1。重组鸭AvBD2蛋白在-20～100℃或pH 3～12条件下处理30 min后仍有抗金黄色葡萄球菌作用。【结论】克隆并表达了鸭AvBD2基因,表达产物具有抗菌活性,对温度和酸碱度有较高的稳定性。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及生物活性分析

[目的]研究鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及反应原性鉴定。[方法]将S1基因克隆到pMD18-T质粒载体上构建pMD18-T-IBV-S1载体;将目的基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点区,并将构建的重组质粒转化至宿主菌BL21中;IPTG诱导后的蛋白做SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析。[结果]S1基因在大肠杆菌中成功地进行了表达,表达的融合蛋白约为66kD,以包涵体形式存在。免疫印迹试验显示,重组蛋白可被IBV多克隆抗体识别。[结论]S1重组蛋白具有反应原性,为进一步研究IBV的新型疫苗奠定了基础。     

家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2(NS2)的表达及活性研究

 【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2（NS2）基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株（BmDNV-Z）基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-Z NS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DNA底物解旋成为单链,并且具有一定的底物极性选择性,对于极性底物表现出更高的解旋活性。同时,纯化的NS2蛋白具有ATPase活性,其酶活力可达到0.276 μmol?μg-1?h-1。【结论】BmDNV-Z NS2基因编码的病毒非结构蛋白具有Helicase和ATPase活性,并且Helicase活性具有一定的底物极性选择性,推测该基因在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在大肠杆菌中的表达及其特性研究

将大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(LTB)基因eltb克隆到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21/DE3/plyss。采用SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明,在大肠杆菌中高效表达了LTB蛋白,其产量约为细菌总蛋白的20%,GM1-ELISA方法鉴定目的重组蛋白可与GM1结合,具有潜在的佐剂活性;由纯化的重组蛋白免疫小鼠制备的抗血清效价为1:16000,并且可以特异性识别天然毒素。结果表明,所表达的LTB有良好的抗原性和佐剂活性,制备的抗血清具有良好的免疫活性,为下一步以LTB作为佐剂的黏膜疫苗研究提供基础材料。     

新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF39L基因克隆、表达及抗体的制备

为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构建原核表达质粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2;将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2;用所得融合蛋白分别免疫小鼠,获得了高效特异抗体39Ab1和39Ab2;利用制备的抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示,VP39参与了SGIV的装配。本研究结果为进一步研究ORF39L基因在SGIV感染过程中的作用机制提供了数据资料。     

猪链球菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的原核表达及其粘附相关功能初探

目的:克隆、表达猪链球菌2型菌株ZY05719的膜蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶基因(hm6),分析其重组蛋白的生物学活性。方法:基于GenBank中S.suis P1/7SSU1634蛋白的基因序列设计引物,克隆ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因并进行序列分析;构建pET28a-hm6原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达,重组HM6蛋白即二氢硫辛酰胺脱氢酶用His亲和层析镍柱纯化后,通过SDS蛋白电泳鉴定分析并利用新西兰大白兔制备抗血清,研究其酶活性及其在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中的作用。结果:克隆了1 761bp的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,纯化的70kD重组融合蛋白具有良好的酶活性和免疫原性,且在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中具有作用。结论:成功克隆、表达了ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,初步揭示了其生物学活性,为深入研究二氢硫辛酰胺脱氢酶在猪链球菌致病机制中的作用奠定了基础。