禽流感病毒A／Turkey／Canada／63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒（AIV）A／Turkey／Canada／63毒株，提取病毒基因组总RNA，应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段，并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明，该毒株的HA基因全长为1745bp，含有完整的阅读框架，编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp，编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示，该毒株HA基因属于H6亚型，NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析，表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80．5％～87．3％，氨基酸的同源性为88．0％～93．1％；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86．0％～93．5％，氨基酸的同源性为90．6％～96．3％。     

不同源性H5亚型禽流感病毒株HA基因序列分析

本研究对1株鹅源和一株鸽源的H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因进行扩增、克隆和序列分析。结果表明，所扩增的片段长均为1707bp，包含完整的开放阅读框架，编码568个氨基酸；该毒株有7个潜在糖基化位点；在HA裂解位点附近有6个碱性氨基酸序列插入。两毒株间核苷酸与氨基酸的同源性均为96．7％。该毒株与参考毒株的序列比较分析结果表明：核苷酸同源率分别为95．3％～99％；氨基酸同源率分别为95．1％～99.3％。     

H9N2亚型猪流感病毒A／Swine／Shandong／1／02分离株的基因序列分析

从有肺炎症状的病猪中分离到1株H9N2亚型猪流感病毒（SIV）A／Swine／Shandong／1／02，对其进行了全病毒基因序列分析。结果表明，该毒株8个基因片段的核苷酸序列均来自禽流感病毒（AIV），与我国目前家禽中流行的H9N2亚型AIV毒株具有很高的同源性，与A／Duck／Hong Kong／Y280／97（H9N2）的同源性为94．1％～98．9％，与A／Chicken／Beijing／1／94（H9N2）的同源性为94．5％～98．2％；推导的其血凝素（HA）裂解位点处的氨基酸序列为P—A-R—S-S-R，完全符合H9亚型AIV欧亚分支中的类A／Chicken／Beijing／1／94亚分支的特征；基因分析结果表明，该分离株的所有基因片段均来源于H9N2亚型AIV，它可直接感染猪，并导致发病，但它并未在猪体内发生重组。     

1株黑天鹅源H5N8亚型禽流感病毒遗传演化分析

为分析1株黑天鹅源H5N8亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化特征,对2021年从北京圆明园遗址公园送检的黑天鹅样品中鉴定出的1株H5N8亚型禽流感病毒(A/Wild swan/China/Beijing0201/2021)的全基因组进行扩增、克隆与序列测序,并应用分子生物学软件对其进行遗传演化及关键氨基酸位点分析。结果显示,该H5N8亚型禽流感病毒株属于clade2.3.4.4b进化分支,其PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、MP、NS基因均与H5N8亚型AIV的相应基因片段具有较高同源性,且与2020-2021年越南、哈萨克斯坦、俄罗斯、柬埔寨、法国等地的H5N8毒株密切相关。氨基酸位点分析显示,该毒株HA蛋白裂解位点呈现高致病性禽流感病毒的分子特征,且出现S137A、T160A、T192I、S227R氨基酸突变,158位缺失糖基化位点,这些位点的突变均能够增强H5亚型禽流感病毒对人源唾液酸受体结合的能力;该毒株的PB2蛋白、NP蛋白、M1蛋白和NS1蛋白均存在多个可以增强流感病毒在哺乳动物体内的复制能力和致病性的关键氨基酸位点。研究结果可为H5N8亚型禽流感病毒的进化规律研究及...     

一株番鸭源N6亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及序列分析

为了丰富水禽源流感病毒神经氨酸酶基因（NA）的分子流行病学资料,通过对2008年分离自福建省某种番鸭1株罕见的H6N6亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）NA基因进行克隆分析,发现该毒株NA基因全长为1431bp,开放阅读框为1380bp（19～1398）,其中从第175～207位缺失33个核苷酸：其编码459个氨基酸,颈部存在有11个氨基酸的缺失（TNSTTTIINNN）,为在N6亚型神经氨酸酶基因中首次报道有颈部缺失。该NA基因和我国分离的A／duck／Eastern China／01／2007（H4N6）NA基因的核苷酸同源性最高,达97．1％,并处在同一遗传进化分支上;与其它H6N6亚型AIV分离株NA基因的同源性均较低,同源性处在78．3％到79．6％之间,相互之间遗传关系较远,其它H6N6亚型AIVNA基因在遗传进化上呈独立进化分支。     

禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因克隆及序列分析

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)(GD3/96)NA基因，并对其进行了克隆与测序，该苷酸序列测定结果表明：NA基因全长为1410bp，共编码469个氨基酸。其序列与A/Hongkong/156/97(H5N1)、A/Chicken/HongKong/220/97(H5N1)、A/Goose/guangdong/1/96(H5N1)及A/teal/Hongkong/W312/97(H6N1)分离株核苷酸序列的同源性在88.4%-99.0%之间，其相应氨基酸序列的同源性在89.8-99.2%之间。氨基酸序列与香港流感分离株氨基酸序列相比，在茎部没有出现19个氨基酸残基的缺失，表明香港流感毒株由我国大陆禽流感病毒株直接进化而来可能性不大。     

H9N2亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及其序列特征

用RT—PCR技术扩增到H9N2亚型禽流感病毒分离株A／Chicken／Shanghai／F／98(简称F株)的核蛋白(NP)全基因。18个毒株NP基因核苷酸序列比较结果显示，以Q／HK／G1／97为代表的、并和同期香港发生的人流感事件有直接联系的毒株相互间同源率达98．3％一99．3％，而F株与它们的同源率为92．2％一92．8％。遗传进化分析结果表明，F株独成一组，可暂时划分到类C／Ko／323／96亚系。从目前已发表的H9N2毒株NP基因数据不能确定F株的来源。     

野鸭源H6N2亚型禽流感NS基因的克隆及序列分析

根据GenBank上已发表的H6N2亚型的非结构蛋白基因（NS）序列,设计一对特异性引物,成功从本实验室分离、保存的H6N2禽流感病毒分离株A／Mallard／SanJiang/151／06（H6N2）中克隆到NS基因序列。该克隆基因全长860bp,编码NS1和NS2两种非结构蛋白,与其他H6N2亚型的NS基因进行同源性比较,同源性为71．1％～97．2％,推导的氨基酸序列同源性为62．0％～94．6％。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒株HA基因的克隆与序列分析

本研究对1株鹅源H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因进行了扩增、克隆及序列测定。结果表明：所扩增的片段长1707bp，包含完整的开放阅读框架，编码568个氨基酸。该毒株裂解位点的氨基酸序列为RRRKKR，具有高致病性的分子特征；该毒株有6个潜在糖基化位点；受体结合位点的氨基酸分别为YWIHELY，其左侧壁氨基酸为SGVSSA，右侧壁为NGQSGR。该毒株与国内外一些参考毒株的HA基因序列比较，核苷酸同源率为76.8％～98．1％，氨基酸同源率为85．7％～97．4％，属于欧亚种系。     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NS基因的克隆和序列分析

根据已发表的H5N1禽流感病毒NS基因全序列设计了1对引物，对4株禽流感病毒新疆株的NS基因进行了RT—PCR扩增，并将其克隆到pMD18-T载体上，分别获得了全长为817、851、854、854bp的全基因序列。序列分析结果表明，新疆毒株间的核苷酸同源性为97．8％～98．9%，氨基酸同源性为96．5％～98．7％，与广东、香港和东南亚等不同地区的11个毒株比较，同源性为90．0％～99．4％；与来自野禽、猪等不同种类的11个流感毒株比较，同源性为81．4％～99．3％。系统进化树分析表明，新疆株独立分支。     

一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析

为了解禽流感病毒（AIV）在广西中越边境地区的流行情况，本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒，命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6），对其HA和NA基因进行序列测定，并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示，分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012（H1N2）的核苷酸同源性最高（96.9%），NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016（H5N6）的核苷酸同源性最高（98.2%）。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF，符合低致病性禽流感病毒分子特征；与部分N6亚型禽流感病毒一样，分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外，本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定，结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2，3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6）是一株重组低致病性禽流感病毒。     

一株H9亚型禽流感病毒HA基因的遗传变异分析

对2006年采集的1份禽流感病鸡组织进行RNA抽提后,采用A型流感病毒通用引物进行禽流感病毒HA基因的扩增,并进行T载体克隆及测序,获得了一株H9亚型禽流感病毒的HA序列。序列分析表明,此血凝素基因的ORF由1683个核苷酸组成,编码560个氨基酸,属A／Chicken／Beijing／1／94系。将其在GenBank中Blasl后发现,其与1株珍珠鸡H9N2病毒（A／Guineafowl／Hongkong／NT101／03）和1株鸡H9N2病毒（A／Chicken／Hongkong／AP45／03）的同源性和分值最高,同源性可达97％,较中国2006年前的分离株进化相对稳定,核苷酸的变异不大。切割位点的序列为-PARSSRGLF-,仍属于低致病力毒株。但Gln226Leu的变异,使其成为一种潜在的可感染人的禽源毒株。     

2株H11N3亚型禽流感病毒厦门分离株的基因特征及遗传进化分析

从厦门地区健康鸭群和环境中分离到2株H11N3亚型禽流感病毒(简称SD61和XA33),对其进行全基因组序列测定、遗传演化分析和特殊位点的氨基酸分析。结果显示:2株分离株的HA裂解位点均符合低致病性禽流感病毒特征,NA颈部均无缺失碱基;内部基因中M1基因N30D、T215A突变,PB1基因发生S622G突变,NS1均存在PL基序,为ESEV,SD61株中NS1发生P42S突变,提示当前分离株已出现致病性增强的变化。8个基因片段均属于欧亚谱系,除了HA基因外,与A/duck/Fujian/SD063/2017(H3N3)毒株其他7个基因片段有高度的同源性,同时与浙江、江西、江苏等不同亚型禽流感病毒同源性很高,说明这2株H11N3毒株发生基因重组现象。本研究结果将为本地区禽流感病毒生物学特性研究和防控提供科学依据。     

H9亚型禽流感病毒分离株A／Chick／Shandong／6／96的基因序列分析

对1株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）A／Chick/Shandong/6/96（H9N2）进行了全病毒基因序列分析。结果表明，该毒株8个基因的核苷酸序列皆与1994年分离株A／Chicken/Beijing/1/94（H92）具有很高的同源性（96．0％－98．6％）；推导其血凝素（HA）裂解位点处的氨基酸序列为A－R－S－S－R，完全符合H9 AIV欧亚分支中的类A／Chicken/Beijing/1/94亚分支的特征；虽然其神经氨酸酶（NA）基因与A／Rhicken/Beijing/1/94（H9N2）相比，出现了9个核苷酸的缺失，然而其同源性仍然较高，为97．3％；而与欧亚分支中的类A／Chicken/Korea/323/96和类A／Quail/HongKong/G1/97亚分支的同源性却相对较低，分别为92．0％和84．2％；其它基因的比较情况也大体相近。提示该毒株是由1994年分离株进化而来，在遗传演化上属于H9亚型流感病毒欧亚分支中的类／A／Chicken/Beijing/1/94(H9N2)亚分支。     

鸭源H6N6禽流感病毒贵州株NS基因的克隆及序列分析

为明确贵州地区鸭群中H6N6亚型禽流感病毒(AIV)中非结构蛋白基因(NS)系统进化情况,试验于2014年从贵州省健康三穗鸭体内分离鉴定出的一株H6N6亚型禽流感病毒A/duck/Guizhou/013/2014(DK/GZ/14),对其禽流感病毒NS基因进行扩增,并克隆到p MD-18T载体中测序,获得NS蛋白的完整编码序列;同时将NS核苷酸序列与Gen Bank中已有的参考序列作比对。结果表明:DK/GZ/14的NS基因与江西毒株2009年鸭源H6N6亚型禽流感病毒同源性最高,达99.5%;由遗传进化树可知,NS基因在遗传进化关系上与2009年广西分离株位于同一分支,而与2005年分离的汕头毒株不处于同一分支,DK/GZ/14与邻省的H6N6毒株亲缘关系较近。     

我国2006年野鸟H5N1 HPAIV表面基因进化特征

国家禽流感参考实验室在2006年,从来自青、藏两省(区)3种野鸟及辽宁省的2种死亡的野鸟体内共分离到14株H5N1亚型高致病力禽流感病毒(High pathogenic avian influenza virus,HPAIV),比较发现其HA、NA基因核苷酸的同源率在97.9%～99.9%之间。所有病毒的HA基因的裂解位点均具有HPAIV特有的连续碱性氨基酸-RRRKKR-,并具有近年来H5N1亚型流行株所特有的NA基因颈部49～68位20个氨基酸缺失及NS基因80～84位5个氨基酸的缺失;遗传进化分析表明2006年野鸟病毒由2005年野鸟病毒进化而来,并形成独立的进化分支;辽宁省近2年的4株野鸟病毒亲缘关系较近,说明引起2005年该省锦州地区H5N1 HPAI疫情的病毒在该地区的野鸟体内继续存在。     

1株重组的H5N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

本研究对1株H5N2亚型禽流感病毒(CK/GD02/14)进行全基因测序及遗传进化分析,结果显示,该病毒HA蛋白裂解位点含有多个连续的碱性氨基酸(321PQIEGRRRKR*GLF333),为高致病性禽流感病毒特征。遗传进化分析结果显示,CK/GD02/14与A/chicken/Jiangsu/1001/2013(H5N2)各基因片段都有较高的同源性(97.6%~98.9%)。HA基因位于H5N1亚型遗传进化树的7.2分支,NA基因属于H9N2亚型遗传进化树的BJ/1/94-like分支。其内部基因与1株H9N2亚型病毒的内部基因有较高的同源性,但其M基因属于类H5N1病毒分支,表明该H5N2亚型禽流感病毒为H9N2和H5N1亚型禽流感病毒的重组毒株。结果表明,CK/GD02/14与A/chicken/Jiangsu/1001/2013(H5N2)为同源毒株,可能由江苏传到广东地区。     

H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/Heilongjiang/301/2007非结构蛋白基因全序列扩增及分析

2007年秋我们从迁徙水禽绿头鸭(Anas platyrhynchos)中分离出一株H6N1亚型低致病性禽流感病毒A/Mallard/Heilongjiang/301/2007.通过设计特异性引物对其非结构蛋白基因(NS)进行了全序列的扩增,并在GenBank中的序列进行比较,发现A/Mallard/Heilongjiang/301/2007属于欧亚系禽流感病毒,此株病毒NS基因与duck/Hokkaido/Vac-1/2004 H5N1株NS基因同源率高达98.5%,可能与北海道地区禽流感病毒具有共同起源.另外此株病毒NS基因在263～277位并没有发生15碱基的缺失,所以应属于等位基因A,亚系Ⅰ型.     

一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的基因组测序及遗传进化分析

对2016年分离自华东地区某活禽交易市场的一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒A/duck/Anhui/D0642/2016(H6N6)进行了全基因组序列扩增和测序,以及序列同源性比对和遗传进化分析。结果显示,该分离株的HA基因与野禽源病毒A/turtledove/Wuhan/HKBJ62/2015(H6N6)的核苷酸一致性最高,推导的裂解位点处氨基酸基序为P-Q-I-E-T-R-G,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;NA基因无茎部缺失,与早期分离株A/duck/Fujian/6159/2007(H6N6)具有最高的核苷酸相似性;内部基因中,仅NP基因与H6N2亚型禽流感分离株的核苷酸相似性最高,PB2、PB1、PA、M和NS基因均与近几年的H6N6亚型病毒关系紧密。进一步的分析表明,D0642株的8个基因片段均属于欧亚进化谱系,可能由H6N6和H6N2亚型重组产生;并且NA和PB2基因还与当前国内优势流行的2.3.4.4分支H5N6亚型禽流感病毒关系密切,可以为其在自然界的进一步重组提供基因片段的来源。因此,须加强对H6亚型禽流感病毒的流行病学监测。     

1株西藏H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的遗传进化分析

分析1株西藏H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化特征。利用RT-PCR法对H5亚型抗原阳性流感病毒核酸检测,并分子克隆、核苷酸测序,再利用DNASTAR、MEGA7.0软件进行同源性分析和基因遗传进化分析。经基因遗传进化分析表明,H5N1亚型禽流感病毒和2012年孟加拉国分离株亲缘关系最近,属于同一分支,HA蛋白裂解位点处有较多碱性氨基酸,从分子上表明西藏毒株H5N1是高致病性禽流感病毒。对西藏分离株H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因进行遗传进化分析,为西藏H5亚型禽流感病毒感染防控具有指导意义。