鸡传染性支气管炎X毒株S1基因的克隆与真核表达

根据GenBank中报道的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因序列，设计了1对引物，克隆了IBV强毒株X的S1基因，基因大小为1．62kb。将其导入真核表达载体系统pIRES1neo中，表达蛋白为61000。     

鸽源冠状病毒PSH中国分离株S1基因克隆及分子进化分析

对分离鉴定的鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白S1基因进行RT-PCR法扩增、克隆和序列测定分析.结果表明其S1基因由1 626个核苷酸组成,编码541个氨基酸,S蛋白的切割识别位点为精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸（RRFRR）,与常见的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S蛋白切割识别位点相似（RRF/SRR）.该病毒与火鸡蓝冠病病毒（TCV）Gh、G1株S1基因推导的氨基酸同源性仅为24.7%、25%,而与IBV H52、H120、M41、Beau、Conn、Gray、Hotel、SH1、SH2、SH5、SH6基因推导的氨基酸同源性在75.0%～99.6%,其中与SH2、SH5的氨基酸同源性更是达到了99.6%,进一步证明该冠状病毒可能来源于IBV.     

上海地区鸡传染性支气管炎病毒S2基因的检测及分析

参考GenBank发表的传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）S基因序列，设计合成了1对引物，模拟PCR表明，该引物能扩增现已发表的所有IBV的S2基因部分核酸序列，扩增片段493bp。建立的RT—PCR检洲体系检测灵敏度达10～50ELD50，检出限量为0．1ng。采集上海地区12个鸡场疑似IBV禽样品34份进行检洲，阳性为32份，序列分析表明均为肾变型IBV S2基因片段，S2基因同源性较高（≥99％），与其他地区肾变型IBV也有较高同源性，而与腺胃型和呼吸型相比较，序列差异较大。进化分析表明，尽管IBV S2片段变异率明显低于S1基因，但二者表现相同的进化趋势，S2基因亦可反映出IBV的分子变异及毒株间的亲缘关系。     

2012—2014年我国鸡传染性支气管炎分子流行病学调查

为了解近年来我国鸡传染性支气管炎病毒的主要类型,2012—2014年,从华东、华北和华中等地区出现传染性支气管炎（IB）的养鸡场中,采集病料进行病毒分离。从中分离鉴定出IBV流行株69株。对所有分离株进行S1基因扩增、测序和遗传进化分析。结果显示毒株共包含6个基因型,根据各基因型中包含的毒株数量多少依次为：QX型（54株,占78.26%）、Mass型（6株,占8.7%）、4/91型（3株,占4.35%）、TW-I型（2株,占2.90%）、tl/CH/LDT3/03型（2株,占2.90%）和CK/CH/LSC/99I型（2株,占2.90%）。将GenBank中收录的所有2012—2014年间国内分离株S1基因序列下载并构建遗传进化树,结果表明QX型IBV已成为当前国内流行的绝对优势基因型。     

鸡传染支气管炎病毒分子生物学研究概况

叙述了国内外对鸡传染性支气管炎病毒（IBV）呼吸道变型、肾病变型及腺胃病变型的研究和分类；IBV的复制及纤突蛋白S；S1基因变异和重组；IBV分子生物学诊断技术；IBV核蛋白免疫的研究等。     

RT—PCR及RFLP分析技术对鸡传染性支气管炎病毒的诊断和S1基因分型的研究

本研究使用分别扩增整个S1整个S1糖蛋白基因（引物A）和S1糖蛋白基因N-端高变区I（引物B）的2对引物对3个IBV标准株M41、Connecticut、Arkansas及5个地方分离株（C60，D41A，D41B，A1121，A1171）进行RT-PCR扩增，用引物A时，有5个IBV毒株扩增到目的片段（1720bp)；用引物B时，所有8个IBV毒株均得到与预丈夫大小相符的目的产物（228bp)，对1720bp的PCR产物用限制性内切酶HaeⅢ进行酶切，结果得出3个不同的RFLP图谱，其中M41、Connecticut、D41B具有相同的HacⅢ酶切图谱，Arkansas和D41A则分别具有互不相同的图谱；对228bp的PCR产物进行DdeI、RsaI限制性内切酶消化，根据它们的RFLP图谱，8个IBV毒株可分为5个基因型，综合2对引物的PCR产物的PCR产物的RFLP分析结果，8个IBV毒株可分为7个基因型，分型的结果与传统的血清学方法吻合，本研究建立的方法和技术具有快速、简单、特异灵敏等优点，为现场流行毒株的定型（基因型/血清型）及其S1基因变异的跟踪研究以及更有效防制传染性支气管炎奠定了基础。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank已公布的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列,设计1对IBV S1基因表达片段的PCR引物,用RT-PCR方法扩增出长度为1 566 bp IBV S1基因表达片段,5′端不含信号肽序列,3′端添加了终止密码子。用限制性内切酶SnaB和Not将S1基因和载体pPIC9K酶切回收后连接,构建了重组表达载体pPIC9K-S1。用限制性内切酶Bgl将表达质粒pPIC9K-S1线性化,然后用电转化的方法导入毕赤酵母GS115,在MD平板上生长的转化子经过PCR鉴定和表型筛选后,获得了整合型阳性重组菌株GS115/pPIC9K-S1 His Muts。将重组菌株在1%甲醇中进行诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,IBV S1基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的分子量约为76 000,能与IBV阳性血清特异性结合,表达的蛋白占上清中总蛋白量的12.5%。     

传染性支气管炎病毒分离株的生物学特性鉴定及其遗传变异分析

通过鸡胚矮小试验、鸡胚气管环组织培养试验、干扰新城疫病毒复制试验和动物回归试验,将2006-2007年在江苏省分离的7株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）鉴定为嗜肾型毒株。采用RT-PCR扩增IBV分离株的S1基因,并进行克隆和序列分析。结果显示7个IBV分离株S1基因的核苷酸同源性为94．6％-99．4％,处于同一个群,分别属于3个亚群。这些毒株与大多数国内近年分离株的同源性较高,而与Massachusetts、T、4／91和793B血清型毒株（包括H120和H52疫苗毒株）的同源性较低。IBV流行毒株和疫苗毒株的差异是造成免疫鸡群发生传染性支气管炎的重要原因。     

鸡传染性支气管炎病毒基因型与血清型相关性初步研究

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因型与血清型之间的相关性,本研究以国内不同地区的17株IBV分离株、2株疫苗株(M41、W93)和1株强毒株(X株)为研究对象,经RT-PCR扩增获得20株IBV的S1基因并进行测序.将其分别与GenBank中的20株国内外参考IBV株的S1基因进行序列比较,绘制S1基因系统进化树...     

传染性支气管炎病毒纤突蛋白S1基因的T/A载体克隆策略

参考Genbank收录的IBV纤突蛋白 (S1)基因序列 ,自行设计合成一对引物 ,对传染性支气管炎病毒 (IBV)江苏省地方分离毒株 (JS/95/0 3)RNA进行RT PCR扩增 ,产物经琼脂糖凝胶电泳分析 ,呈现一条 1716bp的条带 ,将其克隆入T/A质粒pMD18 T载体中 ,转化大肠杆菌JM10 9,挑选阳性克隆 ,用质粒少量提取法提取重组质粒 ,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切对重组克隆质粒进行鉴定 ,然后进行序列测定 ,证实为S1基因。将此重组质粒命名为pMDJS950 3S。     

鸡传染性支气管炎病毒基因工程疫苗研究进展

鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病,是严重危害养禽业的重要传染病之一.IBV为冠状病毒科（Coronavirdae）,冠状病毒属（Coronavirus）的代表成员,病毒粒子有囊膜和纤突,基因组为一条单股正链RNA,具有27kb,分为10个开放阅读框架（ORF）;基因组主要编码3种结构蛋白：纤突（S）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白,其中S蛋白由S1和S2两种糖蛋白组成,血凝抑制和大多数中和抗体由S1蛋白引起.     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方分离株S1基因的RFLP基因分型的研究

采用RT－PCR方法分离得到了五个IBV地方分离株（HN2，HN4，JX1，SC2和SC4）的S1基因片段，并用限制性内切酶HaeⅢ对五个IBV地方分离株S1基因的cDNA进行RFLP分析。结果显示，五个IBV地方分离株S1基因cDNA的HaeⅢ带型与标准毒株M41和Beaudette相同。根据Kwon建立的RFLP分型标准，本试验的五个地方分离株应归属于马萨诸塞血清型。     

免疫鸡群IBV的分离鉴定及其S1基因序列研究

为了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)变异情况,对2018—2019年多次发生疑似鸡传染性支气管炎(IB)的广西某公司发病鸡群进行IBV的分离鉴定,并对分离株进行S1基因序列测定、同源性、系统进化树和重组分析。结果显示:共分离到5株IBV,其S1基因核苷酸相似性为85.2%～99.9%;5株IBV中3株S蛋白裂解位点为HRRRR,2株为RRFRR;2018年分离的2株IBV属于LX4型中的QXⅡ亚型,与疫苗株QXL87处于同一个分支;2019年分离的3株IBV为LDT3-A型,且均为重组毒株,来源于分离株GX-YL161022(QXⅡ亚型,主亲本)与参考株CK/CH/LSC/99I(次亲本)的重组。研究表明这5株IBV主要为LX4型毒株及其参与的重组株,未及时免疫与流行株基因型相同的疫苗以及重组导致的变异可能是造成该养殖场免疫失败的主要原因。     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)ZZ2004株核衣壳蛋白基因的克隆及原核表达

本研究旨在克隆并表达鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的核衣壳蛋白（N）。根据IBV ZZ2004株的N基因设计1对引物,提取IBV ZZ2004株的RNA,利用RT-PCR技术扩增大小约1.23 kb的片段,将其插入克隆载体pGEM-T构建pGEM-T-N。将pGEM-T-N用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pGEX-6P-1,转入大肠杆菌BL21（DE3）菌中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳,结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白;Western blotting检测结果显示N蛋白可与相应的IBV ZZ2004阳性血清发生特异性反应,结果表明N蛋白有一定的生物活性。本研究为IBV诊断试剂盒及新型IBV重组亚单位疫苗研制奠定基础。     

鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白基因的遗传变异分析

对鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白基因进行了RT—PCR扩增、克隆和测序。结果表明，PSH株S基因由3504个核苷酸组成，编码1条由1167个氨基酸残基组成的多肽。S基因编码产物裂解后形成的S1和S2亚单位分别由541和626个氨基酸残基组成。PSH株S蛋白切割识别位点为精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸（RRFRR），与多数鸡传染性支气管炎病毒（IBV）切割识别位点相似（RRF／SRR）。与GenBank中其他冠状病毒毒株S基因的推导氨基酸序列相比较，PSH株与IBV参考毒株的同源性为79．3％～99．6％，而与其他冠状病毒包括火鸡蓝冠病病毒和SARS病毒的同源性均小于37．8％。表明，鸽源冠状病毒PSH株属于第3抗原群冠状病毒，且与IBV亲缘关系较近。     

一种新型快速鉴定IBV的方法

澳大利亚墨尔本大学兽医系的科学家们最近研发出了一种利用高分辨率融解曲线和数学模型快速鉴定传染性支气管炎病毒（IBV）的方法。研究人员通过采用RT—PCR结合高分辨率融解凸线（HRM）对IBV的3＇UTR区域进行检测并由此进行分型。HRM曲线由来自于IBV的230-435bpPCR产物进行绘制,并采用数学模型对这些数据进行了分析。结果显示,这种方法具有极高的分辨率（189／190）,结果与采用3’UTR和S1基因进行的鉴定结果一致。结果表明,这种结合RT—PCR和HRM曲线的分析方法可以快速鉴定新型和与疫苗株相关的IBV类型。     

GI-19型(QX型)鸡传染性支气管炎病毒的病原特性分析

为了解GI-19型(QX型)鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的病原特性,筛选6株GI-19型IBV进行EID₅₀测定以及鸡胚致病力和雏鸡致病性试验,并应用高通量测序技术进行基因组测序,分析病毒基因组和主要结构蛋白编码基因生物特性。结果显示:IBV/Chicken/Hubei/S1402/2021分离株对鸡胚有致病性,导致鸡胚表现胚体蜷缩、矮小等典型病变特征,经SPF鸡胚传代至第5代,表现较为稳定的EID50 (10^-5.33/0.1 mL),但其对雏鸡无致病性;IBV/Chicken/Sichuan/C1452/2021分离株对鸡胚没有致病性,但将其接种1日龄雏鸡,可导致雏鸡出现33.33%(5/15)的发病率,引起的典型病变为雏鸡肾脏尿酸盐沉积。对6株GI-19型IBV分离株的基因组和主要结构蛋白编码基因进行系统进化分析和生物特性分析,发现IBV/Chicken/Hubei/S1402/2021分离株与其他分离株存在明显差异,且在1a和1b基因区域存在重组现象。结果表明:我国流行的部分I...     

嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒W93疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因序列，设计了两对引物并以RT－PCR特异性扩增出嗜肾型IBV W93疫苗株的S1基因，基因产物大小为1.62kb，与设计相符，对其进行序列测定后，与标准毒株H52、H120、M41、BEAU株的S1基因进行同源性比较，结果表明，W93株与H52、H120、M41和BEAU株的核苷酸序列的同源性分别为96．8％、97．1％、96．9％和96．8％，由此可以看出嗜肾型IBV W93疫苗株与标准毒株在S1基因上具有高度的同源性。     

抗传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

选取传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)M41毒株S1蛋白的重要抗原区,RT-PCR扩增选定的S1基因并构建pET-28a-S1重组表达载体,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE以及Western blot结果显示重组S1蛋白表达正确。以纯化的S1蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备并获得了抗IBV M41 S1蛋白的单克隆抗体3D9。免疫过氧化酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)结果显示,单克隆抗体3D9可与IBV M41毒株反应。成功表达了截短的IBV S1蛋白并获得了能识别IBV M41毒株的单克隆抗体,为IBV检测方法的建立奠定了基础。     

禽传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体制备及其中和抗原表位的鉴定

为鉴定禽传染性支气管炎病毒(IBV)刺突(S1)蛋白的中和抗原表位，本研究通过IBV全病毒免疫BALB/c小鼠，经融合、亚克隆筛选获得了4株稳定分泌抗IBV S1蛋白抗体的杂交瘤细胞株4A11、1B11、5E5和7C9。经鉴定制备的单克隆抗体腹水抗体ELISA效价为10⁶以上，Western blot和间接免疫荧光试验分析显示该单克隆抗体反应性和特异性良好。随后用8种基于S1分型的IBV毒株为试验毒株，同实验室已有的8株IBV S1单抗(1E9、1H1、1E4、3C6、3C7、2F3、2E5、4F9)共12株单抗进行气管环中和活性检测，发现S1蛋白单抗与8种S1亚型的毒株均有不同程度的中和作用。随后，在抗原表位和Western blot分析的基础上，鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域，获得了6个中和抗原表位，其中除⁴¹⁶IQTRTEP⁴²²表位，其他5个表位仍未有相关报道。本研究成功制备出4株特异性识别S1蛋白且具有中和活性的单克隆抗体，不仅丰富了IBV的单克隆抗体库，为今后研究IBV S1蛋白分子结构提供了关键生物材料...