果蝇硫化氢合成相关基因在不同虫态的转录水平

构建了23个物种的甲硫氨酸腺苷转移酶、甘氨酸N甲基转移酶、胱硫醚β合成酶和胱硫醚γ裂解酶的氨基酸序列的系统进化树,进化分析表明这4类蛋白均具有基本一致的系统进化关系,并且均被归为昆虫和哺乳动物两大类群。通过实时荧光定量PCR方法分析了黑腹果蝇不同发育阶段编码甲硫氨酸腺苷转移酶、甘氨酸N甲基转移酶、胱硫醚β合成酶和胱硫醚γ裂解酶的M(2)21AB、CG6188、CG1753和Eip55E基因的mRNA水平。结果显示:M(2)21AB基因mRNA水平在各发育阶段间无显著差异;CG6188基因mRNA的表达量在卵期较低,到了幼虫期显著升高,尤其在2龄幼虫期达到最高,而在蛹期和成虫期明显下降;CG1753基因mRNA的表达量在幼虫期明显上升,至蛹期达到最高水平,而在成虫期又显著降低;Eip55E基因mRNA水平在幼虫期、蛹期及成虫期均比卵期显著提高。以上结果表明,内源性H2S在黑腹果蝇中具有重要的生理学功能。     

巴西橡胶树中谷胱甘肽及其合成代谢途径关键酶活性的研究

硫醇广泛存在于巴西橡胶树胶乳中,其主要成分为还原型谷胱甘肽(GSH),在橡胶树产排胶和死皮中发挥重要作用。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)是催化GSH生物合成的限速酶,谷胱甘肽还原酶(GR)在NADPH作用下催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原为还原型GSH。GSH的抗氧化能力很大程度上取决于其在胞内的浓度及GSH/GSSG的比率。本研究发现健康橡胶树胶乳中的硫醇含量、γGCS和GR活性高于死皮树。H2O2能增加PR107、RY7-33-97和RRIM600 3个品系橡胶树幼苗叶片中GSH/GSSG比例、γGCS和GR活性,其中RRIM600上调最为明显,PR107变化最小。研究结果为进一步揭示硫醇在产排胶和死皮中的作用提供了实验证据,同时也为阐明橡胶树活性氧与死皮的关系奠定了基础。     

深淹胁迫对三峡库区狗牙根谷胱甘肽代谢途径的影响

以三峡库区自然消落带野生狗牙根为研究对象,进行自然条件下不同水位深度(0、5、10、15、20、25、30 m)的深淹胁迫以及胁迫后恢复试验,对谷胱甘肽合成、循环代谢关键酶及物质含量进行分析。结果表明,深淹胁迫后,狗牙根可以通过增强谷胱甘肽合成及循环代谢关键酶:谷胱甘肽还原酶和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性,维持植物体内谷胱甘肽水平及氧化还原状态,从而抵御深淹造成的氧化伤害。深淹恢复生长30 d后,狗牙根谷胱甘肽、总谷胱甘肽含量、谷胱甘肽还原酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性恢复至未淹对照水平。从植物对深淹胁迫的生理响应上,表明狗牙根作为禾本科植物在遗传上具有一定的耐淹能力,可以作为三峡水库消落带植被恢复的物种。     

山药花青素合成关键酶基因的解析

测定了紫山药和白山药叶、茎、块茎中的花青素含量、积累量和积累速率,以及花青素合成酶基因PAL、F3H、DFR、ANS和UFGT的实时表达。结果表明:除了DFR基因外其他基因在山药幼嫩组织中的表达水平更高;所有基因在紫山药块茎中的表达水平较高;ANS和UFGT在紫山药中高度表达,而在白山药中低表达或不表达;块茎中花青素的动态积累量呈一个典型的双"S"曲线;PAL和F3H基因只在花青素积累速率最快之前的块茎膨大初期高度表达,而DFR、ANS和UFGT表达水平的两个高峰期与花青素积累速率的两个高峰期符合。推测控制紫山药颜色的关键酶基因可能是ANS和UFGT或两者之一。     

基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用

以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U爛mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U爛mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择.     

小麦淀粉合成相关酶的研究现状

对小麦碳代谢过程中相关酶进行了综述,重点分析了与淀粉合成相关的酶。蔗糖合成酶、磷酸蔗糖合成酶、ADPG焦磷酸化酶和淀粉合成酶都是淀粉合成的关键酶。     

合浦珠母贝含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因特征与表达分析

研究了合浦珠母贝含硒谷胱甘肽过氧化物酶(命名为poSe-GPx)基因结构特征和在应激状态下的表达调控机制,其cDNA全长为1271 bp,5′-非编码区(UTR)长28 bp,3′-UTR长631 bp,包括4个RNA不稳定信号结构域(ATTTA)、1个保守的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和1个位于poly(A)尾巴上游22个核苷酸处的多聚腺苷信号(AATAAA).开放阅读框(ORF)为612 bp,编码由203个氨基酸组成的多肽,分子质量约23.1 ku,理论等电点为8.29.poSe-GPx第51个氨基酸为硒代半胱氨酸(Sec),由密码子TGA编码.poSe-GPx序列中存在1个保守的GPx签名序列75LGFPCNQF82、1个活性位点序列162WNFEKF167和1个糖基化位点87NCT89.利用MatGAT软件对poSe-GPx氨基酸序列和其他物种GPx序列进行同源性和相似性分析,结果表明:poSe-GPx与其他物种GPx序列具有较高的保守性,同源性为42%-55%,相似性为56%-71%.组织表达模式分析表明:poSe-GPx mRNA在消化腺、鳃、性腺、血细胞、闭壳肌、肠和外套膜中都有表达.免疫应激试验结果显示,在2和4 h时poSe-GPx基因在消化腺中的表达显著上调.     

拟南芥木聚糖合成关键酶基因的调控研究

【目的】从目前已知的参与拟南芥Arabidopsis thaliana次生壁加厚生长的转录因子着手,分析这些次生壁相关的转录因子是否能够调控木糖合成关键酶基因FRA8、IRX9、IRX10、IRX14、F8H、IRX9-L、IRX10-L和IRX14-L的表达,并且观察KNAT7基因显性抑制植株的表型.【方法】通过Gateway技术构建效应器和报告器,进行瞬时转录激活试验,同样构建pCAMBIA1304-p35S∷KNAT7-SRDX重组质粒,用农杆菌Agrobacterium tumefaciens花序浸染法将此质粒转化到野生型拟南芥植株中.【结果和结论】瞬时转录激活试验表明,转录因子KNAT7、MYB46、ERF72、SND1、NST2能够激活多个拟南芥木聚糖合成关键酶基因的表达,其中KNAT7能促进基因FRA8、IRX9和IRX14-L的表达.KNAT7基因显性抑制能显著影响拟南芥的生长.试验结果表明KNAT7基因可能在木聚糖的合成中起着重要的调控作用.     

纳米硒对肉鸡肝脏谷胱甘肽过氧化物酶和脱碘酶Ⅰ活性的影响

以亚硒酸钠为对照,研究了纳米硒对肉鸡肝脏谷胱甘肽过氧化物酶和脱碘酶Ⅰ活性的影响.健康Avian商品代公母混合雏1485羽按饲养试验要求分为11组,每组3个重复,每个重复45羽.将纳米硒和亚硒酸钠2种硒源分别以0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/kg 5个硒水平添加到基础日粮中,配制成10种试验日粮,并以基础日粮作对照.结果显示:亚硒酸钠添加浓度在0～0.20 mg/kg,肉鸡生长性能和GSH-Px活性随着硒添加浓度的增加而提高;在0.20～0.40 mg/kg硒添加水平范围内处于高峰平台;0.50 mg/kg硒添加水平肉鸡生长性能和GSH-Px活性显著低于0.20～0.40 mg/kg硒添加水平(P＜0.05).纳米硒添加浓度在0.50 mg/kg,肉鸡生长性能和GSH-Px活性仍然保持在高峰平台.硒源添加浓度在0.10～0.40 mg/kg时,亚硒酸钠和纳米硒对肉鸡生长性能和GSH-Px活性的影响无显著差异(P＞0.05);硒源添加浓度在0.50 mg/kg时,纳米硒组肉鸡生长性能和GSH-Px活性显著高于亚硒酸钠组(P＜0.05).基础日粮组肝脏脱碘酶Ⅰ活性显著低于各硒源的各硒添加水平(P＜0.05),硒源和硒添加水平对脱碘酶Ⅰ活性没有显著影响(P＞0.05).上述结果提示,纳米硒的Weinberg剂量-效应的最适剂量范围宽于亚硒酸钠.     

霜霉病菌诱导大白菜几丁质酶和葡聚糖酶基因的表达

以大白菜抗霜霉病菌品种为材料,采用实时定量PCR技术检测接种霜霉病菌(Peronospora parasitica)后几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的表达。结果表明,霜霉病菌接种处理显著诱导了几丁质酶基因在大白菜抗病品种中的表达,但β-1,3-葡聚糖基因的表达却呈现双峰曲线特点,表明这两种基因可能在大白菜对霜霉病抗性中起到了重要作用。     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因酿酒酵母表达载体的构建

以重组质粒pBAD-LRCP-126为模板,经PCR扩增获得了PLRV缺失突变CP基因的特异性条带。目的片段与pYES2.1/V5-His/-TOPO的连接产物转化大肠杆菌TOP10F′获得了氨苄青霉素抗性菌落,酶切与DNA测序结果确认了酵母表达载体的正确性,该表达载体命名为pYES-LRCP-126。在30℃,酿酒酵母工程菌株INVSc1(pYES-LRCP-126)经2%半乳糖诱导培养16h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条23kDa的诱导表达的蛋白条带,其大小与预期的重组CP大小相符,表明PLRV缺失突变基因在酵母菌中实现了表达。     

糖化酵母糖化酶基因在酿酒酵母中的克隆与表达

[目的]使酿酒酵母高效表达糖化酵母糖化酶基因.[方法]利用PCR技术从糖化酵母中扩增出大小为2700 bp左右的带有启动子的糖化酶基因STA1.通过限制性内切酶BspDI与Acc65I双酶切,将目的基因STA1连接到穿梭质粒pRS416中构建重组质粒pRS416-sta1,转化酿酒酵母通过筛选.[结果]糖化酶活性最高为120 U/ml,酶的最适温度为60℃,最适pH为5.0,在酶催化反应2h后,酶剩余活力能达到约90％.[结论]通过基因工程手段得到高效表达糖化酶基因的酿酒酵母工程菌株.     

基因敲除GCV2的酿酒酵母构建

[目的]构建低甲醇生成的酿酒酵母工程菌用于酿造低甲醇酒。[方法]利用基因敲除技术,敲除酵母代谢甘氨酸生成甲醇途径的甘氨酸裂解酶系的基因GCV2。[结果]成功构建出基因敲除GCV2的工程酵母L5,用L5酿造酒中的相对甲醇含量为131 mg/L,比初始菌株的192 mg/L降低31%。[结论]利用基因敲除GCV2的工程酵母菌可有效减少酒中由甘氨酸代谢生成甲醇的量。     

阿维链霉菌aveC基因缺失对产素调控的影响

通过构建仅含有aveC基因两端交换臂的缺失载体,与阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)染色体中aveC基因发生同源重组,以阻断该基因,从而获得aveC缺失突变株。并经摇瓶发酵和高效液相色谱检测不同阿维菌素组分产量。结果显示,aveC缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量差异不显著;而阿维菌素组分1的产量下降约58%,组分2的产量提高约52%。     

YDL080 c基因缺失的低异戊醇酿酒酵母菌构建

[目的]构建YDL080c基因缺失的低异戊醇生成的酿酒酵母菌。[方法]利用Cre-lox P重组系统与酵母电转化法敲除酿酒酵母中编码类丙酮酸脱羧酶的基因YDL080c,切断酿酒酵母代谢中的异戊醇生成,从而构建一株低异戊醇生成的酿酒酵母菌株。[结果]成功构建出YDL080c基因缺失的工程酵母菌Y1,Y1酿造酒中相对异戊醇含量为0.81 g/L,比初始菌降低28.3%。[结论]利用基因敲除YDL080c的工程酵母菌能够有效减少酿造酒中异戊醇的生成量。     

mleA基因在酿酒酵母中的整合型表达

 【目的】进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌 SD-2a（Oenococcus oeni SD-2a）的苹果酸－乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸－乳酸发酵（malolactic fermentation,MLF）同时进行。【方法】克隆Oenococcus oeni SD-2a的苹果酸－乳酸酶基因mleA,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母整合型质粒YIp5为载体,构建重组表达质粒pYILmleA,并转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS59,经筛选鉴定获得酵母转化子YS59/pYILmleA。进行转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE检测及斑点杂交检测,并对酵母转化子培养上清液进行L-苹果酸及L-乳酸含量的HPLC分析,检测目的基因的功能性表达。【结果】转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定表明获得了阳性转化子;SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了目标蛋白,斑点杂交检测表明目的基因整合到受体菌中。模拟发酵表明mleA基因整合到受体菌中后进行了功能性表达,将培养基中的L-苹果酸转化成L-乳酸,使得培养液中的L-苹果酸含量极显著降低。转化子YS59/pYILmleA在添加5 648 mg?L-1 L-苹果酸和10%葡萄糖的SD/-Ura培养基中培养4 d,培养液上清中L-苹果酸的剩余含量与空载体转化子YS59/YIp5（对照）差异极显著,苹果酸的相对降低率为20.18%～20.85%。供试的转化子L-乳酸生成量为1 278～1 312 mg?L-1,对照未检出乳酸的生成。【结论】中国自主筛选的专利菌种O.oeni SD-2a的mleA基因的整合型表达质粒构建成功并在酿酒酵母中进行了功能性表达。     

条斑紫菜TPS基因TPP结构域的缺失突变

条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)基因(PyTPS)具有TPS及TPP双结构域,以该基因的原核表达载体pET22b-PyTPS为材料,利用双酶切片段替换法对该基因TPP结构域磷酸酶基序的编码框Box1与Box2进行了缺失突变.第一,用715bp缺失Box1的KpnI-EcoRI人工合成片段替换pET22b-PyTPS中相应的片段,获得了缺失Box1的突变基因PyTPS-Box1.第二,用661bp缺失Box2的EcoRI-HindII片段进行替换,获得了缺失Box2的突变基因PyTPS-Box2.第三,在缺失Box1后,再通过替换缺失Box2,获得了同时缺失Box1与Box2的突变基因PyTPS-Box1-Box2.本研究既获得了三种突变基因,又获得了其原核表达载体,为研究PyTPS基因的编码活性提供了材料,奠定了基础.     

高产谷胱甘肽酵母菌株的筛选及其抗乙硫氨酸诱变研究(英文)

[Objective] The aim of this study was to screen Saccharomyces for glutathione over-production. [Method] Ethionine-resistant mutants were obtained through UV mutagenesis and rational screening. [Result] A high GSH-producing strain HSJB1 was isolated from soil, and the biomass for this strain by flask shaking fermentation was 3.87 g/L while the GSH yield was 91.87 mg/L. According to the morphological, physiological and biochemical characteristics of cells, this strain was primarily identified as Saccharomyces cerevisiae. An ethionine-resistant mutant YBS77 was obtained through UV mutagenesis of the original strain HSJB1, and the biomass for this strain by flask shaking fermentation was 7.60 g dry cell weight/L while the GSH yield was 211.96 mg/L. [Conclusion] The biomass of the mutant obtained by breeding is increased by 96.38% than that of the original strain, and the GSH yield of the mutant obtained by breeding is increased by 130.72% than that from the original strain, which indicates that the breeding method is feasible.     

流产布鲁氏菌2308株磷酸甘露糖变位酶pmm基因缺失株构建及鉴定

旨在构建流产布鲁氏菌2308株pmm基因缺失株。PCR扩增流产布鲁氏菌2308株pmm基因的上、下游同源臂片段,并与枯草芽孢杆菌上SacB基因片段融合。连接至自杀载体PGEM-7Zf+,构建自杀载体PGEM-7Zf+Δpmm-SacB。电转化至流产布鲁氏菌2308株感受态细胞内,通过氨苄抗性和蔗糖敏感性筛选,获得基因缺失株2308Δpmm,对其进行PCR鉴定和稳定性检测。成功构建可稳定遗传的2308Δpmm基因缺失株,并在15代内未发生回复。在此基础上可以对2308Δpmm进行深入研究。