伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据已经发表的伪狂犬病病毒（PRV）Rice株的gE基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV闽A株糖蛋白gE基因除信号肽以外的全部编码区段,并克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌XL1-blue菌株,重组质粒pMD18-T-FL经酶切和PCR鉴定证实后,进行了序列测定。结果表明,重组质粒pMD18-T-FL含有PRV闽A株糖蛋白gE基因除信号除信号肽以外的全部编码区段,长1674bp。序列比较分析表明,此区段与PRV Rice株相应区段的核苷酸序列同源性为97．5％,氨基酸序列同源性为94．8％。     

内江猪γ干扰素基因的克隆、序列分析及真核表达载体的构建

将内江猪的外周血淋巴细胞在刀豆素（ConA）的刺激下培养24 h后，提取总RNA,应用一步法RT-PCR扩增γ干扰素（IFN-γ）cDNA,克隆到PMD18-T载体，命名为pMD-N-IFN-γ，测序结果证明克隆的cDNA全长603 bp，其ORF为501 bp，编码166个氨基酸，与Genbank公布的IFN-γ比对，核苷酸同源性在99.4%以上，从而证实成功地克隆了内江猪IFN-γ基因。以pMD-N-IFN-γ质粒为模板亚克隆完整ORF区,连接到真核表达质粒pcDNA3.1(+)的EcoRI、XhoI两位点之间，经单双酶切鉴定，成功的构建了IFN-γ真核表达载体pcDNA3.1(+)-N-IFN-γs。     

堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽基因的克隆和序列分析

卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓｃａｌｍｅｔｅ－ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）是一种活的减毒性结核菌苗。目前,国内外科学家正致力于运用基因重组技术,将ＢＣＧ发展成一种新型重组活载体疫苗［１,２］。本研究对堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽基因进行了ＰＣＲ扩增、克隆和序列分析,...     

牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因（Follistatin,FSTN）基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结...     

hIL-18基因真核表达载体的构建及序列分析

在获得人白细胞介素18(hIL-18)基因重组质粒pGEM-T-hIL-18的基础上,用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切该质粒,回收小片段hIL-18基因;同时双酶切真核表达质粒pECFP-C1,回收大片段,二者连接转化大肠埃希菌感受态细胞.对重组质粒pECFP-C1-hIL-18进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,测序结果表明,克隆至pGEM-T中的IL-18 cDNA包含成熟IL-18的全部编码序列.本研究获得了融合有报告基因pECFP-C1的真核表达载体,为下一步进行hIL-18在真核细胞中的表达打下了良好的基础,亦为在基因水平上探讨hIL-18的生物学功能提供了物质基础.     

抗ICAM-1单链抗体基因的克隆及序列分析

应用 RT- PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 ICAM- 1单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 F12中 ,扩增出抗体VH和 VL 基因 ,用 linker(Gly4 Ser) 3基因 ,将 VH和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆到 p MD18- T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 74 4 bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排鼠抗体可变区基因特征。 VH和 VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 (B)和轻链к 家族     

K88-ST融合基因的克隆及真核表达载体的构建

利用DNA重组技术，将编码K88-ST融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pCAMBIA 1302中，成功的构建了植物重组表达质粒pCAMBIA-K88-ST。并将其转化农杆菌EHA105，为K88-ST基因的进一步研究奠定基础。     

鸭Ⅰ型干扰素基因的克隆与序列测定

从植物血凝素（PHA刺激的鸭外周血单核细胞提取总RNA，采用RT-PCR扩增鸭Ⅰ型干扰素（DuIFN-Ⅰ）基因。将其克隆到pMD-18T载体中，进行序列测定。克隆到的鸭Ⅰ型干扰素基因与已公布的DuIFN-α核苷酸序列同源性为99.65%。氨基酸序列同源性为98.95%。同时表明，鸭外周血单核细胞在PHA刺激下能够表达Ⅰ型干扰素mRNA。     

ANXA2真核表达载体的构建

以膜联蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)真核表达载体的构建过程为基础,介绍一种易于成功构建真核表达载体的方法。以Hela细胞来源的cDNA为模板,半套式PCR为基础,通过两次PCR的方法,可获得5’端添加Kozak序列并融合表达HA标签基因和ANXA2的基因片段Kozak-HA-ANXA2,回收后克隆到pMD-18T克隆载体,获得合适的酶切位点,再采用双粘端连接法将其克隆入慢病毒真核表达载体pTRIP中。结果显示,经双酶切和测序之后确定真核重组载体pTRIP-HA-humANXA2构建成功。通过半套式PCR方法构建真核表达载体成功率高,为下一步细胞表达试验创造条件。     

抗隐孢子虫子孢子表膜单链抗体基因的克隆和核苷酸序列分析

应用RT－PCR技术，从分泌具有抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞3D6中扩增出抗体VH和VL基因，用linker(Gly4Ser)3基因，将VH和VL基因连接成ScFv基因，并将其克隆至pMD-18T载体中。经核苷酸序列分析证实，VH、VL基因和linker基因拼接正确，基因全长为720bp。经计算机分析，VH和VL基因均为新发现的基因序列，符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（A）和轻链κⅢ家族。     

恶臭假单胞杆菌转谷氨酰胺酶基因的克隆及原核表达载体的构建

通过PCR方法扩增恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)H76的转谷氨酰胺酶(transglutaminase,TGase)基因,然后将扩增的约800bp的基因片段克隆到pET-28a( )表达载体上,构建重组TGase的表达载体.酶切鉴定阳性的重组质粒命名为pET-TGase.核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与恶臭假单胞杆菌KT2440的相应基因有很高的同源性.该载体的构建为进一步研究转谷氨酰胺酶的生物学功能以及应用提供了基础.     

鸡β-防御素-2基因的克隆及原核表达载体的构建

鸡β-防御素是一类广谱抗菌阳离子小肽的总称,一般具有3个分子内二硫键。防御素对细菌、真菌乃至某些被膜病毒具有广谱杀伤作用。试验根据已发表的Gal-2基因序列,设计并合成了一对引物。以骨髓中的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的片段并克隆到pGEM-TEasy载体上,经筛选鉴定获得阳性重组子pGEM-T-Gal-2。再经EcoRI、XbaI双酶切,插入pMAL-c2x质粒构建表达载体。利用PCR技术和酶切反应筛选转化子成功获得pMAL-c2x-Gal-2重组质粒。     

伪狂犬病病毒上海株EP0基因的序列分析及其表达载体的构建

以伪狂犬病病毒上海株 (PRV SH)细胞感染物为模板 ,PCR扩增出 1 2 3kb的EP0基因完整编码区片段 ,将该基因片段克隆到pGEM T easy中 ,经过双脱氧末端终止法序列测定 ,并同国内的PRV Ea株进行同源比较 ,发现PRV SH株EP0基因存在多处突变和一处插入。进一步将该片段插入到原核表达载体 pET32a (+)的His Tag下游 ,构建了的原核表达质粒 pETEP0 ,为今后深入研究该基因的表达及其功能奠定了基础。     

J亚群禽白血病Hrb-1分离株env基因克隆及gp85杆状病毒表达载体的构建

自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT-PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS-103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取质粒分别用HindⅢ,BamHI进行单酶切和双酶切鉴定,得到了阳性重组质粒pMD18-T-Hrb-1/env,对其进行Pst Ⅰ酶切,回收包含J亚群禽白血病病毒株Hrb-1 gp85基因的997bp片段,应用Bac to Bac杆状病毒表达系统,将外源片段与线性化的杆状病毒载体pFast Bac HTA进行连接,获得重组载体pFAST BacHTA/gp85,将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得了杆状病毒重组载体Bacmid/gp85,为表达gp85并建立适于国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础.     

中内毒素(LPS)诱导后家蝇幼虫抗菌肽Cec Md基因的克隆、生物信息学分析及其表达载体的构建(英文)

从脂多糖(LPS)诱导或非诱导的家蝇幼虫体内抽提总RNA,根据家蝇Cecropin基因(GenBank:DQ 232774)设计特异性引物,应用RT-PCR技术扩增出编码CecMd开放阅读框(ORF)的cDNA序列,将其克隆入pMD18-T载体,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将CecMd亚克隆基因与线性化的pET32a(+)连接,构建重组表达载体pET32a(+)/CecMd,并对此基因及其推导氨基酸序列进行系统的生物信息学分析。结果表明从脂多糖(LPS)诱导的家蝇幼虫体内成功的扩增出家蝇抗菌肽Cecropin基因,命名为CecMd,但是从未诱导的虫体内未能获得此基因;CecMd开放阅读框的cDNA全长为192 bp,编码由63个氨基酸残基组成的多肽;此多肽最可能的裂解位点在氨基酸残基A23和G24之间,提示1~23氨基酸残基组成信号肽,24~63氨基酸残基构成成熟肽;CecMd的全长肽包含4个螺旋,成熟肽(不包括信号肽)含有2个螺旋,两者均不含二硫键;CecMd与果蝇Cecropins的同源性显著高于其他昆虫,达到81.0%以上;经PCR,限制酶切和DNA测序鉴定表明,成功构建了重组表达载体pET32a(+)/CecMd。重组表达载体pET32a(+)/CecMd的构建及其CecMd基因的生物信息学分析对其生物学功能研究和高效表达工程菌的构建具有重要意义。     

长穗偃麦草EeHKT1;4基因的克隆与植物表达载体构建

采用RT-PCR方法从长穗偃麦草(Elytrigia elongata)中克隆得到高亲和K+转运蛋白基因,命名为EeHKT1;4,全长cDNA序列为1 977bp,开放阅读框1 722bp,编码573个氨基酸,与一粒小麦(Triticum monococcum)TmHKT1;4-A2的氨基酸同源性为94%。系统进化树分析结果显示,EeHKT1;4与单子叶植物HKT1;4亲缘关系较近。利用In-Fusion技术,成功构建了pBI121-35SEeHKT1;4-Nos植物表达载体,为长穗偃麦草EeHKT1;4的耐盐功能鉴定奠定基础。     

水牛KDM4D基因克隆分析及其真核表达载体的构建

旨在克隆水牛组蛋白去甲基化酶KDM4D (lysine K-specific demethylase 4D)基因,对其进行生物信息学分析,并构建KDM4D基因的真核表达载体,为研究KDM4D基因在水牛体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎发育中的作用奠定基础。试验从水牛睾丸组织中提取总RNA,反转录cDNA后, RT-PCR技术克隆KDM4D基因片段,并运用生物信息学软件对序列进行分析;随后将KDM4D基因片段连接至真核表达载体pEGFP-C1,再把重组质粒转染进HEK293T细胞。结果表明,克隆所得的水牛KDM4D基因片段编码区全长1 155 bp,共编码384个氨基酸。水牛KDM4D基因与黄牛、山羊、绵羊、犬、猫、猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别为98.4%,96.6%,96.3%,84.9%,84.1%,81.4%,80.4%,77.4%,77.3%。多重比较和进化树分析结果显示,KDM4D基因在不同物种及生物进化中具有较高的保守性。蛋白结构域分析显示,克隆所得的KDM4D蛋白结构特殊,只具有1个JmjN (Jumonji N)和1个JmjC (jumonji C)结构域,与KDM4家族其他成员相比缺少PHD (plant homeodomain)和Tud (tudor)功能域。KDM4D蛋白质三级结构预测结果显示,水牛、黄牛和人3种物种间具有较高的相似性。转染结果显示,构建的重组质粒可以在HEK293T细胞中表达。本试验成功克隆水牛KDM4D基因,对其进行生物信息学分析,构建了真核表达载体pEGFP-C1-KDM4D,并在HEK293T细胞中成功表达。     

金黄地鼠（Mesocricetus auratus）朊蛋白基因的克隆及其原核表达

采用RT-PCR技术从金黄地鼠(Mesocricetus auratus)脑组织获得朊蛋白基因(Prion protein nucleic acid,PRNP)开放阅读框(Open reading frame,ORF),截去其N端信号肽(66 bp)和C端GPI锚定位点(69 bp)形成朊蛋白编码区PRNPx;将编码区重组于融合表达质粒Pet-DsbA中,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中经IPTG诱导表达,并经Western-blot验证。结果表明,金黄地鼠PRNP基因ORF区全长为765 bp,编码254个氨基酸的前体蛋白,核苷酸序列与已发表金黄地鼠序列(M14054)同源性为99.87%,其第116个氨基酸发生了同义突变由GCT变为GCC;朊蛋白在大肠杆菌得到高效表达,产物是相对分子质量为47 000的融合蛋白。     

猪附红细胞体SRP54基因的克隆及真核表达质粒的构建

为了研究猪附红细胞体信号识别颗粒54（SRP54）基因的功能,试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体KI₃806全基因组序列（登录号为NC₀15153.1）中信号识别颗粒（SRP）蛋白基因设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增猪附红细胞体SRP54基因片段,将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,重组质粒经PCR和酶切鉴定后测序,并将SRP54基因与pVAXⅠ真核表达载体连接。结果表明:克隆的SRP54基因片段长1 173 bp,与GenBank中原序列同源性为97%,构建的真核表达质粒pVAXⅠ-SRP54经PCR和酶切鉴定正确,为猪附红细胞体SRP54基因的后续研究奠定了基础。     

伪狂犬病病毒闽A株糖蛋白gD基因去信号肽片段在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR方法从包含伪狂犬病病毒（PRV）Fa株糖蛋白gD基因的重组质粒pB13中扩增出糖蛋白gD基因去信号肽片段，将其克隆到大肠埃希氏菌表达载体pThiohisA中。测序结果表明，糖蛋白gD基因去信号肽片段长1155bp，与PRVFa株糖蛋白gD基因完全一致。经1mmol／L IPTG诱导后，重组质粒pThiohisA-gD在大肠埃希氏 菌XL1-blue、Top10、DE3和DH5a中均得到表达，其中在宿主菌XL 1-blue中表达量最高。Western-blotting结果显示，大肠埃希氏菌XL1-blue表达的糖蛋白gD具有免疫原性。