猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)荧光PCR检测方法的建立

猪链球菌病是严重危害人兽健康的一种传染病。常规的猪链球菌血清学检测方法不但费时，而且只能鉴定到血清型。荧光PCR技术是一种新型扩增待检基因的方法，采用“闭管”操作，灵敏度比常规PCR高出100倍以上，而且整个过程只需要0．5～2h，还可避免常规PCR操作时EB染色的危害及PCR后处理可能带来的假阳性，是目前为广大科研工作者所青睐的一种病原的快速鉴定方法。本研究选择MRP设计引物进行PCR，反应结束即可根据扩增曲线判定有无目的基因，从而确定待检菌是否为猪链球菌2型致病株。本方法的建立，为疫情发生后，有针对性地采取紧急防控措施、严防疫情传入传出奠定了基础。     

猪链球菌2型PCR诊断方法的建立

根据猪链球菌2型荚膜多糖基因序列设计1对引物,建立了猪链球菌2型PCR诊断方法,该方法对猪链球菌2型的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对猪链球菌2型检测的灵敏性为1 pg总DNA量。并用建立的PCR诊断方法检测40份猪链球菌疑似病料,检出阳性病例12份。以上结果表明,该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪链球菌2型疾病的诊断。     

猪链球菌2型的分离鉴定及致病性试验

从济南某猪场急性死亡的病例中,采集猪心血、肺、肝、脾和淋巴结等组织器官,通过病原分离,药敏试验,猪链球菌2型荚膜多糖基因(cps2J)的PCR检测及动物试验分别对其进行病原、药物敏感性、血清型和生物学特性等初步研究。结果表明:分离菌的形态、培养特性及生化特性符合链球菌的特点,cps2J基因PCR扩增均出现长度为675 bp的特异性条带,其核苷酸序列与GenBank中猪链球菌2型参考菌株的cps2J基因序列同源性达98%～100%,由此证明其病原菌为猪链球菌2型。对小鼠的致病性试验表明能100%致死小鼠。     

猪链球菌检测及分型方法研究进展

猪链球菌是一种重要的人畜共患病病原,有多个血清型,不同血清型的毒力也不相同,因此,对猪链球菌的鉴定和分型就显得尤为重要。目前,有许多方法应用于猪链球菌的检测及分型,包括常规的病原学诊断、血清学方法、生化实验以及应用最为广泛的分子生物学技术。本文就这几种方法展开详细的论述。     

猪链球菌病双重PCR诊断方法的建立

根据猪链球菌2型荚膜多糖和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的保守区序列分别设计了2对简并引物,建立了一种能同时检测猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法。结果显示,该双重PCR能从100个细菌的混合纯培养物中扩增出2条目的片段。而且可以直接从病料组织中检测到相应的病原菌。用建立的双重PCR方法和细菌分离培养法平行检测人工感染的组织病料,PCR方法与细菌培养法的阳性检出率基本一致,但PCR方法的特异性好、敏感性高,简便易行,可以用于猪链球菌病的流行病学调查和实验室的快速鉴别诊断。     

猪链球菌2型多重PCR检测方法的建立及应用

设计3对引物,分别扩增链球菌属特异性gdh、猪链球菌种特异性16S rRNA和猪链球菌2型特异性cps2J等基因,目的片段大小分别为725bp、523bp和387bp。利用合成的3对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了多重PCR。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1105株,检出猪链球菌667株,猪链球菌2型33株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。     

猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16SrDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型（1或／和2型）型特异基因序列设计了4条引物，建立了快速检测猪链球菌2型（1或／和2型）的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示，所建立的多重PCR方法特异、敏感，对组织中的猪链球菌2型（1或／和2型）的最低检出水平为30CFU／mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测，并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证，结果显示，检出阳性符合率为100％，证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。     

猪链球菌2型LUX荧光PCR检测方法的建立

猪链球菌2型是一种严重的人兽共患病病原,为满足猪链球菌2型快速检测的需要,本研究根据猪链球菌2型Cps2J保守区设计LUX引物,首次利用LUX PCR方法对猪链球菌2型进行检测,并进行了敏感性和特异性试验及模拟样品检测试验。结果显示,本研究建立的猪链球菌LUX 荧光PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性,检测质粒样品的敏感性为10拷贝,检测模拟样品敏感性为10²拷贝,与无乳链球菌、巴氏杆菌、粪链球菌、马链球菌兽疫亚种、沙门氏菌等无交叉反应。该方法的建立为猪链球菌2型的快速检测提供了新的途径。     

双重实时荧光PCR快速检测猪链球菌2型方法的建立及应用

根据GenBank上公布的MRP与CPS2J的开放性阅读框保守序列,运用BEACON Desigener 2.0软件设计和合成了2对引物和其相应的荧光探针,优化各个反应物的浓度和实时荧光PCR循环程序,建立从组织中直接检测2型链球菌主要毒力因子MRP与CPS2J的实时荧光PCR方法.双重实时荧光PCR检测2型猪链球菌方法能够从病料中直接检测2型猪链球菌并可以检测出该菌的主要毒力基因MRP,运用该方法可以最低检测到24CFU/mL 2型猪链球菌,并且与其他血清型链球菌和其他病原菌无交叉反应.特异性良好.通过对8个样品在3个不同时间的检测.结果显示该方法的稳定性和重复性均很好.     

一例猪链球菌2型感染的病原分离鉴定及药敏试验

2016年2月,上海市崇明区某乡镇一规模养猪场出现40多头5~8周龄仔猪发病死亡情况。经细菌分离、分离菌株生化鉴定和PCR检测,确诊为猪链球菌2型感染。对该菌株采用K-B纸片法,进行10种常用抗菌药物的体外药敏试验,结果发现该细菌对青霉素、阿莫西林、恩诺沙星敏感,对诺氟沙星、阿奇霉素、壮观霉素、卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素和氨苄西林不敏感。根据药敏试验结果,建议养猪户使用阿莫西林和恩诺沙星进行治疗,并做好病猪的隔离与护理。一周后病情得到控制。     

猪链球菌14型的分离鉴定及生物学特性研究

为了检测确定2019年5月河南某规模化猪场一栋保育仔猪发病猪群的病原,本研究从送检的发病猪关节液中分离获得1株细菌。通过细菌纯化培养、革兰氏染色、形态学观察及猪链球菌gdh基因PCR扩增,确定该分离菌株为猪链球菌。用猪链球菌分型引物对该菌株进行PCR扩增分型鉴定及软件比对分析,结果表明该分离菌株为猪链球菌14型,与猪链球菌JS14株（GenBank登录号：CP002465.1）同源性为100%。毒力基因检测结果表明,该菌株的同时携带有epf、mrp、sly、fbps、orf2毒力基因,属于高致病性菌株。小鼠致病性试验结果也证明该菌株是一株高致病性猪链球菌。药物敏感性试验结果显示,该菌株对β内酰胺类和喹诺酮类药物敏感,对氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类和磺胺类高度耐药,表现出多重耐药现象。对该菌株进行5大类24种耐药基因检测,该菌株同时携带有bla_TEM、aadA1、strA、strB、aacC2、aphA1、tet（B）、gyrA、parC、sul2耐药基因。该研究为后续进一步开展猪链球菌14型流行特点和致病机制研究奠定了基础,为猪链球菌14型临床防控提供了理论依据,同时具有重要的公共卫生意义。     

致病性猪链球菌2型的病原分离鉴定及毒力因子的PCR检测

通过对广西某猪场急性死亡的猪进行病原分离,分离到革兰氏阳性球菌,用链球菌快速鉴定试剂条Rapid ID 32 Strep鉴定为猪链球菌2型;并对分离菌进行猪链球菌2型荚膜多糖抗原（cps2J）及其重要毒力因子溶菌酶释放蛋白（MRP）、细胞外蛋白因子（EF）和溶血素（SLY）的多重PCR检测,同时对cps2J基因进行序列测定,与GenBank发表的猪链球菌2型相比,同源性为98.8%,毒力因子MRP、EF和SLY检测均为阳性,证实广西某猪场急性死亡的猪为高毒力猪链球菌2型感染所致。动物试验中,该菌可引起小白鼠部分死亡,家兔体温最高升至40.3℃,最后败血而死。     

一株猪链球菌8型菌株的分离鉴定及其生物学特性研究

为明确天津市某猪场保育猪疑似发生猪链球菌病的病原菌及其致病力等生物学特性,将猪场一头发病猪扑杀,无菌采集病料于哥伦比亚血琼脂平板上划线培养,对分离的疑似菌株进行形态学观察、生化试验、16S rDNA序列分析和血清型鉴定,确定分离菌株为猪链球菌8型,命名为TJS31.药敏试验结果显示,TJS31株对8种受试药物耐药,4种...     

猪链球菌7型的分离鉴定及药敏试验

某猪群暴发类似猪链球菌病,为确诊和防制该病,通过将病料接种到血液营养琼脂培养基和TSA培养基分离细菌,对分离菌株进行生化鉴定和PCR鉴定,并接种小白鼠进行动物试验和药敏试验。结果表明,分离的细菌为猪链球菌7型,对小白鼠具有致病性,且对恩诺沙星和头孢唑啉高度敏感。该结果对临床防制猪链球菌病具有参考意义。     

天津地区2型猪链球菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解天津地区2型猪链球菌的流行及耐药情况,本研究收集该地区部分规模化养猪场疑似猪链球菌病病料317份,通过病原分离培养、染色特性观察、生化试验、PCR扩增等方法进行鉴定,并对分离菌进行致病性及药敏试验。结果从样品中分离鉴定出11株2型猪链球菌。对小鼠的致病力试验结果显示,应用0.5×10⁸ CFU/mL的细菌攻击小鼠,11株2型猪链球菌分离株中有6株具有致死性,其中1株致死率较强,5株致死率较弱。药敏试验结果表明,11株分离菌对9种临床常见药物均表现出很强的耐药性,其中对阿米卡星、四环素和强力霉素耐药性最强,耐药率达到100.00%;且所有分离株均呈多重耐药,其中4个分离株为9重耐药,占36.36%（4/11）。本试验结果表明,天津地区存在2型猪链球菌感染情况,且对多种抗菌药均产生了耐药性,应引起养殖户的高度重视,在防制猪链球菌病时,应有针对性地合理、科学、规范用药和交替用药。     

猪链球菌血清9型菌株分离鉴定及强毒株筛选

为了筛选猪链球菌血清9型(SS9)强毒株并研究其生物学特性,对全国各地发病猪的病料中进行猪链球菌分离培养。通过形态学观察、革兰氏染色镜检、PCR鉴定及血清型分型确定了29株猪链球菌血清9型菌株,分别命名为SS9-1～SS9-29。通过玉米大蜡螟幼虫和Balb/c小鼠对29株猪链球菌血清9型菌株进行初筛和复筛,筛选出2株猪链球菌血清9型强毒株,分别为SS9-20、SS9-22。为进一步了解SS9-22的生物学特性,对其进行生长曲线绘制、毒力基因检测及小鼠致病性试验。结果显示,SS9-22菌株在37℃培养6 h时,菌液密度可达到最高值。毒力基因检测发现SS9-22的毒力基因型为gapdh⁺/sly⁺/fbps⁺/orf2⁺/mrp~﹣/89K~﹣/gdh⁺/epf⁺。SS9-22菌株经腹腔接种Balb/c小鼠,24 h内可引起小鼠精神萎靡、扎堆、被毛耸立、运动迟缓、死亡等临床症状,该菌株的LD₅₀为3.2×10⁷CF...     

当前猪高热征流行状况及对策

酷夏即将过去,然关于猪高热病的探讨仍在继续。猪高热病,2007年,我国农业部定义为"高致病性蓝耳病",由于病原的多样性,造成发病征状的多样,给确诊带来了一定的困难。2010年,我国猪高热病流行如何,饲料行业为养殖业者提供了怎样的对策。为此,我们特邀本刊专栏作者,在旺大集团一线从事猪料行业服务多年,具有丰富实践经验的吴星和专家作一综述,他欣然答应,提笔速成文,以飨读者。     

临床健康猪群猪链球菌2型带菌率流行情况调查

为了解钦州市临床健康猪群中猪链球菌2型的流行情况,采用PCR方法对采集的病料进行检测分析。374份样品的PCR检测结果显示,链球菌、猪链球菌、猪链球菌2型的带菌率分别为81.8%、48.9%、2.9%,表明钦州市健康猪中猪链球菌带菌率高,但猪链球菌2型带菌率较低。     

9型猪链球菌广东株的分离鉴定和基因序列分析

为了解9型猪链球菌广东分离株毒力因子基因型、基因变异和进化情况,本试验采集发病猪脑脊液、关节液、脾脏、肝脏、淋巴结进行细菌分离培养和生化鉴定,采用PCR方法鉴定其血清型及部分毒力基因,对cps9D、gdh、gapdh与orf2基因进行序列测定和分析,并构建系统发育树。结果显示,分离菌镜检为革兰氏阳性链状球菌,在鲜血琼脂平板中呈β溶血,可发酵大多数糖类,能成功扩增cps9D基因,含重要的保守基因gdh及毒力基因gapdh和orf2,表明分离菌株为9型猪链球菌。分离菌株cps9D、gdh、gapdh、orf2基因核苷酸序列与GenBank上国内外参考菌株的同源性分别为95.9%~100.0%、98.6%~99.8%、98.7%~99.6%和95.5%~99.9%,说明分离菌株与国内外其他9型猪链球菌毒株核苷酸同源性都较高,且与国内外的流行毒株基本一致,未发生太大的变异。系统发育树表明,分离株与国内外来源不同的猪链球菌分离株同源性高,亲缘关系密切。     

广东省1株猪2型链球菌的分离鉴定及部分生物学特性研究

为确诊引起广东省某规模化猪场保育仔猪发生死亡的病因,本试验采集病猪肝脏、脾脏、心脏、脑、关节液和淋巴结等病料进行细菌分离,并对分离菌株进行纯化培养、菌落形态观察、革兰氏染色、形态学观察、生化试验,用血清型特异性引物进行PCR扩增,并进行毒力基因检测、药敏试验、生长曲线测定及动物试验。结果显示,分离菌株在成牛血清琼脂平板上呈圆形、灰白色、表面光滑、边缘整齐的菌落,镜检为革兰氏阳性球菌,呈链状排列。该菌株的生化试验结果符合链球菌的特征,PCR扩增结果显示猪链球菌保守基因片段（gdh和gapdh）和猪2型链球菌特异的cps2J基因片段均为阳性,表明该分离菌株为猪2型链球菌。毒力基因检测结果表明,该菌株毒力因子基因型为gdh⁺/gapdh⁺/epf⁺/mrp⁺/sly⁺/orf2⁺/fbps⁺。分离菌株用营养肉汤培养6 h达到对数生长期,培养10 h的菌液D_{600 nm}值为0.310。药敏试验结果表明,该菌株对青霉素、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸钾等药物敏感,但对强力霉素耐药。动物试验结果表明,感染分离株的BALB/c小鼠未出现死亡且无明显临床症状,毒力较低。本研究为该猪场链球菌病的防控提供了重要参考信息。