单克隆抗体捕捉猪瘟病毒抗原ELISA方法的建立

分别用原核表达的猪瘟病毒（CSFV）主要抗原E2蛋白和猪瘟基因疫苗免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合与克隆筛选出5株稳定分泌CSFV抗体的杂交瘤细胞株1E2、1G7、3A2、3B7和4B6.间接免疫荧光和Western-blotting试验结果表明,5株单抗均与CSFV E2蛋白和全病毒抗原反应.将筛选的CSFV特异性单抗1E2、3B7和4B6纯化后等量混合后包被酶标板（捕捉抗体）,与兔抗CSFV IgG（检测抗体）联合应用,建立起CSFV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）方法.随后采用方阵滴定法确定了单抗与多抗的最适工作浓度及判定检测结果的OD450临界值.最后以建立的AC-ELISA检测CSFV细胞培养物、CSFV攻毒死亡猪的病料和临床猪瘟组织样品,结果表明,该方法敏感、特异、重复性好,与病毒分离和RT-PCR方法符合率分别为86.2%和90.3%.     

草鱼呼肠孤病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立

研究以纯化的羊抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体作为捕获抗体,抗草鱼呼肠孤病毒的单克隆抗体为检测抗体,建立草鱼呼肠孤病毒抗原捕获ELISA检测方法,其最佳反应条件是：羊多克隆抗体包埋浓度为2.5μg/mL,抗草鱼呼肠孤病毒单克隆抗体工作浓度为1:400稀释,以3％牛血清白蛋白作为封闭液。该方法的检测限为5×105 pfu/mL,且能够特异性检出发病草鱼内脏组织中的草鱼呼肠孤病毒。特异性试验结果表明该方法具有较高的特异性,与病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤春血症病毒等水产动物病毒株均不反应。该方法还具有较好的稳定性。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒抗原捕获ELISA诊断方法的建立

采用实验室保存的杂交瘤细胞,通过扩大培养、接种小鼠、收集腹水、腹水纯化等程序得到了猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)单克隆抗体,并对其效价进行了测定.用HEV单克隆抗体作为检测抗体,猪多抗作为捕获抗体,建立了检测HEV的抗原捕获ELISA方法,通过对各步反应条件的优化,最终获得最佳工作条件为:猪多抗1:2 000稀释,单抗1:4 000稀释,酶标抗体为1:4 000稀释.特异性和敏感性试验结果表明:该方法对TGEV、HCV、PEDV和PRV等病毒无特异性交叉反应,其最低检测下线为3.75 mg/L.与RT-PCR方法的对比试验证明,抗原捕获ELISA阳性检出结果与PCR方法相一致.上述结果说明,已成功建立特异、敏感的用于HEV检测的抗原捕获ELISA方法,为临床快速诊断HEV试剂盒的研制奠定了基础.     

抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7.经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb.亚类为IgG1/k.间接ELISA检测杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1:12 800和1:105.硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为1.5 mol/L.应用该A型特异性MAb及实验室已制备的MAb 3D9初步建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA方法.该方法可以检出2.0 ng纯化FMDV和1.0×104 TCID50病毒,与O型、Asial型FMDV及牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数小于8％.本研究建立的抗原捕获ELISA方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用有效的技术手段.     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA方法的建立

以纯化的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作为抗原免疫BALB/C系小鼠,通过细胞融合和克隆筛选出稳定分泌BVDV抗体的杂交瘤细胞株,将杂交瘤细胞接种于BALB/C系小鼠的腹腔内诱生腹水,腹水单抗与BVDV均呈阳性反应.将5A9、2G3和5C2(分别结合不同的抗原结合位点)诱生的BVDV单抗纯化后等量混合包被酶标板,与鸡抗BVDV IgY(检测抗体)联合应用,建立BVDV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法.采用方阵滴定法确定单抗、鸡抗BVDV IgY的最适工作浓度,用阴性组织样品作为判定检测结果的D490临界值,最后以建立的AC-ELISA检测临床粪样棉拭子27份,结果表明:该方法敏感性、特异性高,与全血病毒分离结果的符合率迭86.36%;与全血和粪样RT-PCR检测结果的符合率分别为89.47%和94.74%.阴性对照RT-PCR、病毒分离和AC-ELISA检测均为阴性.     

犬瘟热病毒捕获ELISA试剂盒的研究

建立犬瘟热病毒捕获ELISA,用于该病的快速诊断。方法采用犬抗CDV抗体包被96孔反应板,用以捕获样品中的CDV,再用CDV单克隆抗体和酶标羊抗鼠IgG检测被捕获的CDV抗原,经方阵试验,确立了抗原捕获ELISA的反应条件,并组装ELISA试剂盒。结果用建立的ELISA方法,检测REOV、CPV2、USCCV、CAV-1、CAV-2病毒,均不发生交叉反应;检测犬的临床样本110份。     

流行性出血病病毒抗原捕获ELISA方法的建立

为建立流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,本试验用纯化处理的4种血清型病毒(EHDV-2、5、6和8)混合免疫兔和豚鼠,制备高免血清。以兔抗EHDV为捕获抗体,豚鼠抗EHDV为检测抗体,羊抗豚鼠IgG-HRP为酶标抗体,建立了EHDV抗原捕获ELISA(antigen capture ELISA,AC-ELISA)方法。通过反应条件优化,获得最佳工作条件:5%马血清为稀释液,包被抗体1∶15 000稀释,检测抗体1∶20 000稀释,酶标抗体1∶15 000稀释。通过检测60份阴性样品确定临界值,P/N值≥2为阳性、P/N值1.5为阴性;特异性试验表明该方法仅能检测出各血清型EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、赤羽病病毒(AKAV)及中山病毒(CHUV)无交叉反应;敏感性试验表明该方法可以检出102.47±0.07 TCID50的病毒;批内和批间变异系数均10%;用RT-PCR与该方法同时对70份参考样品进行检测,符合率为92.86%。表明本试验建立的AC-ELISA方法为EHDV抗原检测提供了一种可靠实用的技术手段。     

抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测口蹄疫病毒的研究

本研究用纯化的Asial型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)免疫BALB/c小鼠,按常规单克隆抗体技术方法,经筛选获得6株能稳定分泌抗Asial型FMDV单抗的杂交瘤细胞株。以牛抗口蹄疫病毒IgG为捕获抗体,选择一株单抗(184)用辣根过氧化物酶标记(HRP-184)作为检测抗体,建立了检测Asial型FMDV的抗原捕获ELISA方法。该方法可检出0.5859μg纯化Asial型FMDV抗原和2.5×10~3TCID_(50)病毒,对O型FMDV、牛结核病、牛肺疫、牛流热、赤羽病、牛传染性鼻炎等病毒进行检测,均为阴性,无交叉反应发生。本研究建立的FMDV抗原捕获ELISA方法,具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可用于Asial型FMDV的特异性检测。     

用ELISA猪瘟抗原检测试剂盒诊断猪瘟

近年来，猪瘟的流行特征发生了重要变化，出现了以慢性、阴性感染为主的流行趋势，致使猪瘟的临床诊断更为困难。目前实验室检测猪瘟的方法很多，以抗原一抗体反应为基础的酶联免疫吸附试验(ELISA)被广泛采用，ELISA是快速检测猪瘟的有效方法。笔者利用ELISA猪瘟抗原检测试剂盒，对某猪场送检病料进行猪瘟诊断，取得了较好的效果。     

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原捕获ELISA检测方法的建立

用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立BVDV抗原捕获ELISA(AC-ELISA)检测方法,优化反应条件并对该方法的稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为5μg/mL,兔多抗血清最佳质量浓度为10μg/mL;单抗在4℃包被12~24 h,多抗在37℃作用1 h为双抗体的最佳反应条件;酶标抗体最适稀释度1∶10000,最适作用时间为1 h;采用1%BSA和1%明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭效果好。用AC-ELISA方法检测临床采集的11份牛腹泻病料和12份健康牛组织样品,同时以病毒分离和RT-PCR检测方法做对比,3种方法符合率很高。研究表明AC-ELISA方法稳定性好,可用于BVDV的临床快速检测。     

PPA—ELISA猪瘟免疫检测技术的应用

利用纯化猪瘟病毒抗原包被微量满定板,PPA代替抗抗体的PPA—ELISA猪瘟免疫检测技术,对不同猪瘟免疫程序的猪进行猪瘟抗体的测定,全面评估猪群的免疫质量,以最终达到预防和控制猪瘟的目的。     

牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA检测方法的标准化研究

用纯化牛病毒性腹泻病毒免疫蛋鸡制备出的卵黄抗体作为包被抗体,采用自制的单抗为一抗,建立牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法。通过试验确定,抗牛病毒性腹泻病毒卵黄抗体最佳包被浓度为1:50;McAb最适稀释浓度为1:10,HRP-羊抗鼠IgG工作浓度为1:800。通过引入牛病毒性腹泻病毒质控血清进行质控检验,该方法所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求。标准化的抗原捕获ELISA方法具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点,可广泛应用推广,为我国牛病毒性腹泻病毒监测提供了行之有效的技术手段。     

竞争性ELISA检测猪瘟病毒抗原

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起，主要侵袭家猪及野猪，引起高发病率、高死亡率的烈性传染病。由于其危害严重、流行分布广泛，成为国内外分子病毒学及兽医防疫研究的热点之一。CSFV属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestvirus）成员，与同属的牛病毒性腹泻病毒（Bovineviral diarrhea virus，BVDV）、羊边界病病毒（Borderdiseasevirus，BDV）、长颈鹿瘟病毒（Giraffepestvirus），在病毒结构、抗原性和遗传特性等方面密切相关。     

应用抗原ELISA试验诊断非典型猪瘟

青岛市某大型养猪场,饲养育肥猪271头,日龄100～170d,体重50～100kg,已经全部注射猪瘟、猪丹毒二联疫苗,自2006年2月17日起,陆续出现发病死亡,共发病74头,死亡18头。主要表现为病猪体温升高,多在40℃～41℃,高热稽留不退,精神沉郁,喜卧嗜睡,食欲降低或不食,逐步消瘦,贫血,全身衰弱,病程较长,可达一个月以上,很少急性死亡。初期大便干燥,便秘,5～7d后拉稀,持续到死亡,或者便秘和腹泻交替进行。部分病猪在耳尖、尾尖、腹下、臀部和四肢末梢有紫斑或出血点,病程长的坏死结痂,用青霉素、头孢曲松、利巴韦林和双黄连治疗无效。1病料采集和样品制…     

单抗捕获ELISA检测PRRSV抗体的方法的建立

以国内刚刚研制出的ＰＲＲＳＶ单克隆抗体为基础，建立了检测ＰＲＲＳ病毒抗体的单克隆抗体辅获抗原的ＥＬＩＳＡ法，其单抗包被浓度为１．１６μｇ／ｍＬ，粗提病毒反应浓度为１６．５０μｇ／ｍＬ，血清稀释度为１：４０。经与中和试验以及进口ＥＬＩＳＡ试剂盒比较，证明该法敏感性高，特异性良好，是一种有应用前景的方法。     

流行性造血器官坏死病病毒抗原捕获ELISA建立

使用差速离心浓缩的病毒免疫山羊,获得高免血清并提取IgG,即为抗流行性造血器官坏死病病毒(EHNV)多克隆抗体。利用纯化的EHNV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经有限稀释法亚克隆,获得杂交瘤细胞株。将杂交瘤接种小鼠诱生腹水获得单抗3A4。以抗EHNV多克隆抗体为捕获抗体,单抗3A4为检测抗体,使用HRP标记的羊抗鼠IgG作为酶标二抗,建立了EHNV的抗原捕获ELISA方法。该方法可检出103TCID_(50)的病毒液上清和0.0056!g的MCP重组蛋白。对纯化的GCRV、IHNV、IPNV、VHSV及SVCV病毒液进行检测,结果均为阴性,未发现交叉反应。本研究建立的EHNV抗原捕获ELISA方法,具有敏感、特异和重复性好的特点。通过应用于人工感染样品和临床样品的检测进一步证实了本检测方法的实用性。     

猪瘟病毒RT-PCR核酸检测与ELISA抗原检测试验应用研究

本试验根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株E2基因序列,设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的PCR引物。以120份疑似猪瘟病料为试验材料,使用RT-PCR核酸检测与ELISA抗原检测2种方法,分别用这2种方法检测疑似病料,并且比较这2种方法在猪瘟病料检测中的实际差别。通过猪瘟病毒RT-PCR核酸检测结果及ELISA抗原检测结果相互印证,为云南猪瘟的诊断及防制提供了技术支持。     

检测猪瘟抗原的夹心ELISA诊断试剂盒的制备、标化和应用的研究

猪瘟是由猪瘟病毒 (ＨＣＶ)引起的一种猪的高度接触性传染病 ,病死率高 ,传播迅速 ,蔓延地区广 ,对养猪业构成了极大威胁。本病自 1 83 3年在美国首先被发现〔1〕,迄今仍在世界上大多数养猪国家和地区有不同程度的发生与流行 ,我国的猪瘟疫情在近 2 0年中也呈现新的发病趋势 ,表现为症状、病变的非典型化和复杂化 ,给猪瘟的控制带来了新的难度〔2〕。为了有效地控制猪瘟的发生 ,需要寻求一种可靠、准确、快易的诊断方法。而目前检测猪瘟病毒抗原的直接荧光抗体技术主观性强 ,需要特殊仪器 ,且对判定结果的解释难以标化 ,同时美国研制的单抗…     

McAb捕获抗原检测EDS76病毒抗体的ELISA方法的建立和应用

将三株EDS76病毒单克隆抗体IgG混合,包被ELISA板,捕获病毒抗原后用于检测鸡血清中的EDS76抗体,以OD490nm＞0.3,P/N＞2.1判为阳性结果.经测定,待检血清做1100倍稀释时可以很好地区分阴阳性.所建方法与鸡的其它传染病血清无交叉反应,可被免抗EDS76病毒高免血清竞争性抑制.对11个鸡场330份未接种EDS76疫苗的产蛋鸡血清检测结果表明,血清阳性率最高可达93.33%.     

猪瘟单克隆抗体的制备及ACI-ELISA检测猪瘟病毒的研究

本研究用猪瘟石门毒(CSFV-Shimen)免疫BALB/C小鼠,按常规单克隆抗体(McAb)技术方法制作,最终获得4株McAb,分别命名为AC9、CF8、DG5和EC9,4株McAb与基因工程CSFV E2蛋白反应结果表明:AC9、CF8和EC9是抗CS-FV E2蛋白的McAb.用AC9和CF8McAb对CSFV进行抗原捕获间接ELJSA试验(ACI-ELISA),通过一元McAb和二元McAb CAI-ELISA试验的比较,结果表明AC9与CF8两种McAb有协同作用,其捕获CSFV的能力比一元McAb显著提高.方阵试验结果表明:McAb和血清多抗(PcAb)的最佳工作稀释度分别为1:400和1:200.特异性试验和敏感性试验结果显示本法特异性强,敏感性高.最后用ACI-ELISA与PCR对30份病料的检测结果比较,表明ACI-ELISA与PCR检测结果相符.上述结果说明本研究所获得AC9和CF8可用作猪瘟诊断试剂盒的研制,是检测CSFV的有效方法.