木薯体细胞胚发生过程中抗氧化酶活性变化

以木薯成熟体胚的子叶胚为外植物诱导的体细胞胚为材料,研究其体细胞胚发生过程中抗氧化酶活性(SOD,POD,CAT活性)和过氧化物酶同工酶酶谱的变化。结果表明,木薯体细胞胚发生过程中,SOD活性均在胚性细胞向球形胚转化时下降,鱼雷形胚和子叶形胚发育时升高;而POD和CAT活性呈相反趋势。初步认为,SOD酶活性降低可作为木薯胚性细胞初期分化和胚胎早期发育的一个判断指标。在木薯胚性细胞发生到分化和成熟过程中,过氧化物酶同工酶谱带由5条上升为9条,其中有5种过氧化物酶同工酶稳定出现,这可能是维持细胞基础代谢的一些基因表达的产物。     

龙眼胚性培养物APX同工酶的分析方法建立及其在龙眼体胚发生过程中的变化

以龙眼胚性培养物为材料,进行抗坏血酸过氧化物酶(APX)同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析方法研究,建立一套适合分离龙眼胚性培养物中不同类型APX同工酶的垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法;进一步研究了APX同工酶在龙眼体胚发生过程中的变化,发现在胚性愈伤组织、球形胚、子叶形胚3个阶段APX同工酶存在差异.     

龙眼体细胞胚发生中期的蛋白质组学研究

 【目的】了解龙眼体细胞胚发生中期（球形胚至子叶形胚）蛋白质组的变化,为进一步阐明植物体细胞胚发生的机制提供依据。【方法】进行龙眼体细胞胚发生中期的同步化调控,采用双向电泳和质谱对龙眼体细胞胚发生中期的蛋白质组变化进行分析。【结果】龙眼体细胞胚发生中期表达蛋白的种类随着体细胞胚的发育逐渐减少,但在鱼雷形胚阶段其种类数量有所回升,且增加的蛋白分子质量小于66.0 kD,pI主要集中在5.00—7.00。成功鉴定了35个差异蛋白,发现了多个与体细胞胚发生密切相关的蛋白。1/2以上的蛋白与代谢途径有关,多个蛋白与氧化胁迫有关。RAN2 和 GTPase ObgE在龙眼体细胞胚发生中期发生了活跃的变化。【结论】随着体细胞胚的发育,细胞不断分化,体细胞胚中表达的蛋白种类减少。氧化胁迫相关蛋白、RAN2 和 GTPase ObgE与龙眼体细胞胚发生的调控有关。     

龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中生物大分子的动态变化

测定了龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中若干生物大分子的动态变化.结果表明:龙眼胚性愈伤组织体胚发生过程中淀粉有2个累积峰值,第1次出现在胚性愈伤组织阶段,第2次出现在球形胚阶段,在鱼雷形胚阶段又有一个小回升,这时淀粉积累较心形胚和子叶形胚阶段高一些;随着胚胎的发育,DNA、RNA、总核酸含量的变化趋势大致相同,最高点均出现在心形胚阶段,其中RNA含量的变化较DNA、总核酸含量明显,蛋白质含量的变化曲线呈“S”形.这些生物大分子的动态变化表明,它们对于体胚的发生和发育起着重要作用.     

龙眼体细胞胚胎的高频率萌发与植株再生

以龙眼胚性愈伤组织诱导产生子叶形胚状体为试验材料，比较了蔗糖、活性炭的质量浓度，椰乳的体积分数，光照度和成熟时间等因素对体胚“成熟”的影响以及不同成熟过程、成熟时间、胚状体形态、品种（基因型）等因素对龙眼体细胞胚胎萌发的影响．结果表明，龙眼体胚在含５０ｇＬ－１蔗糖、体积分数为０．０５的椰乳、１００ｍｇＬ－１肌醇的ＭＳ固体培养基上，在黑暗或弱光条件下，不论白色还是透明化（玻璃化）子叶形小胚状体，都可完成“成熟”过程．体胚对成熟培养的蔗糖质量浓度和成熟时间有特定的要求．经过成熟培养的体细胞胚胎，可高频率萌发成苗     

龙眼体细胞胚胎的高频率萌发与植株再生

以龙眼胚性愈伤组织诱导产生子叶形胚状体为试验材料,比较了蔗糖,活性炭的质量浓度,椰乳的体积分数、光照度和成熟时间等因素对体胚“成熟”的影响以及不同成熟过程,成熟时间,胚状体形态,品种（基因型）等因素对龙眼体细胞胚胎萌发的影响,结果表明,龙眼体胚在含５０ｇ·Ｌ＾－１蔗糖,体积分数为０．０５的椰乳、１００ｍｇ·Ｌ＾－１肌醇的ＭＳ固体培养基上,在黑暗或弱光条件下,不论白色还是透明化（玻璃化）子叶形小胚状     

龙眼体胚发生中期发育同步化的初步调控

试验以龙眼"红核子"胚性愈伤组织为材料,对龙眼体细胞胚胎发生进行同步化调控,2,4-D浓度为0.07mg/L时获得了心形胚,2,4-D浓度为0.05mg/L和0.06mg/L时获得了鱼雷形胚,2,4-D浓度为0mg/L时获得了高度同步化的子叶形胚。研究表明,通过培养基中2,4-D浓度的微量调整,基本能够控制龙眼体胚发育中期心型、鱼雷形胚的发育同步化。     

龙眼体胚Obg1基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

本试验克隆了龙眼体胚Obg1基因(DLObg1)的3个转录本.序列分析表明,DLOBG1蛋白具有典型的OBG蛋白结构域,与其他植物的OBG蛋白具有较高的同源性,与葡萄、蓖麻和玉米的氨基酸序列同源性分别为84%、84%和82%.实时荧光定量PCR分析显示,DLObg1基因的转录水平随龙眼体胚的发育而变化,在心形胚和鱼雷形胚阶段的表达量最高,可能与子叶等器官的形成有关.     

高温胁迫诱导龙牙楤木次生体胚发生过程中抗氧化酶活性变化

龙牙楤木成熟体胚经37℃高温处理0～3d于不加任何植物生长调节剂的WPM培养基中产生了次生体胚.结果发现,经高温处理1d的外植体的次生体胚发生最好,诱导率为58％,平均每外植体次生体胚约为4个;高温胁迫过程中及次生体胚发生过程中,3种抗氧化酶活性具有明显变化,且处理1d外植体中,3种抗氧化酶活性始终相对较高;高温胁迫使过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性降低,超氧化物歧化酶(SOD)活性则升高.胚性细胞分化期,即成熟体胚分化形成的球形体细胞胚时期(培养10～15 d),POD、SOD活性相对较高,CAT活性较低;次生体胚发育过程中,即发育形成的鱼雷和子叶体细胞胚时期(培养15d以后),SOD、POD活性呈下降趋势,CAT活性则变化不大.     

棉花子叶衰老过程中的生理生化变化

以棉花子叶为材料,对子叶衰老过程中的叶绿素、可溶性蛋白含量、干物重,三种保护酶(超氧化物歧化酶,过氧化物酶,过氧化氢酶)活性,以及丙二醛含量的变化进行研究。发现子叶在出土后19d开始衰老;叶绿素含量变化在很大程度上与SOD和CAT活性变化存在正相关,与MDA的含量变化负相关,但与POD活性变化不存在相关性。     

龙眼体细胞胚胎高质量浓度蔗糖成熟培养后的超微结构变化

以龙眼红核子品种的松散型胚性愈伤组织诱导的体细胞胚胎为材料 ,研究了体细胞胚胎经 5 0 g· L- 1 蔗糖成熟培养后的超微结构变化 .结果表明 ,经过成熟培养之后 ,龙眼体细胞胚胎细胞在结构和代谢上都发生了根本性的变化 .该研究有助于了解龙眼体细胞成熟机理以及进一步优化龙眼体胚再生系统     

龙眼体细胞胚胎发生过程中特异表达蛋白的双向电泳分析

以龙眼品种红核子LC2胚性细胞系为材料,进行体细胞胚胎(简称体胚)发生及其同步化调控,获取体胚发生过程中各个主要发育阶段的培养物(胚性愈伤组织、球形胚、子叶形胚、早期成熟胚、中期成熟胚、晚期成熟胚),采用双向电泳对体胚发生过程中特异表达蛋白进行分析.结果表明:(1)龙眼胚性愈伤组织中,pI为4-5的酸性蛋白表达种类最多,在体胚发育的过程中逐渐消失,相反,pI为5-6的微酸性蛋白的表达逐渐增多;(2)体胚发育后期,尤其是成熟胚晚期,分子质量大的蛋白大量减少,分子质量较小的蛋白增多并逐渐积累;(3)虽然在各个发育阶段都会出现一些新的特异蛋白,但是没有改变蛋白质种类逐渐减少的趋势;(4)发现了一些有差异的特异蛋白点,尤其是成熟胚后期,有一系列大分子质量的蛋白消失,新出现了一部分分子质量较小的蛋白,其中几种表达量很大,可能与体胚发育有密切关系.     

龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达

以龙眼体胚发生早期的胚性培养物为材料,通过简并引物结合PCR进行cDNA末端快速克隆(RACE)的技术,克隆到了龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5全长序列,其cDNA全长为887 bp,由681个核苷酸组成的开放阅读框,编码226个氨基酸(GenBank登陆号为GQ443759).该基因推导的蛋白分子质量为24511.9 u,理论等电点pI为9.65;该蛋白是Frigi-da-like蛋白质家族成员,是一个具有Frigida组件,无典型信号肽结构,无跨膜螺旋的亲水性蛋白;不规则卷曲是其最大量的结构元件,并且主要集中在C端区域.实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,呈"N"形趋势,其中以不完全胚性紧实结构阶段最高,而鱼雷形胚阶段表达量最低;方差分析表明,鱼雷形胚阶段DlUP-5基因表达量与其他7个阶段存在极显著差异.该研究结果对DlUP-5基因在龙眼体胚发生过程中的作用有了一个初步的认识,其在龙眼胚性愈伤组织胚胎发生能力、早期体胚正常发育和体胚成熟过程等方面可能起重要作用.     

龙眼胚性细胞系的建立与保持

本研究比较了生长调节剂、ＡｇＮＯ３、活性炭、碳源、基本培养基、光照度、胚发育时期以及基因型等对龙眼幼胚培养诱导愈伤组织的影响．从幼胚培养中，诱导出多种类型的愈伤组织，经继代培养并筛选，获得松散、生长旺盛、胚胎发生能力极强的松散型胚性愈伤组织．该类型胚性愈伤组织适宜建立悬浮细胞系和分离原生质体，并且转移至含体积分数为０．０５椰子汁的ＭＳ固体培养基上，形成大量的胚状体．采用在附加１ｍｇＬ－１２，４－Ｄ的ＭＳ培养基与附加１ｍｇＬ－１２，４－Ｄ、０．５ｍｇＬ－１ＫＴ和５ｍｇＬ－１ＡｇＮＯ３的ＭＳ培养基交替继代培养，该类型胚性愈伤组织可长期保持     

贮温对龙眼果肉采后衰老中的抗氧化能力及相关酶的影响

以石硖龙眼Dimocarpus longana Lour. cv. Shixia为试材,研究了不同贮温下3种抗氧化能力(总抗氧化能力TAOC、抑制超氧阴离子能力、抑制羟自由基能力)、相关酶[过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)]及氧化产物[丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)]在龙眼采后果肉衰老过程中的变化规律及相互关系.结果表明:在4和20℃2种贮温下,龙眼果肉均经历了一个不可逆的衰老过程,且高温下的衰老速度远超过低温;氧化产物、3种抗氧化能力和相关酶因贮藏温度不同而出现变化规律和作用水平差异;在较高贮温下,龙眼果肉更易遭受活性氧自由基的伤害,且POD、SOD和CAT对自由基的诱导反应比低温下更加积极.3种抗氧化能力指标在2种贮温下彼此之间均无显著相关性;4℃下,SOD在龙眼果肉低温衰老过程中的抗氧化作用不明显,POD和CAT发挥了主要作用;20℃下,CAT抗氧化作用不明显,而SOD和POD与抑制O2-.能力以及MDA、H2O2含量密切相关,且发挥了主要作用。     

龙眼体细胞胚发生早期的蛋白质组学

【目的】通过龙眼（Dimocarpus longan Lour.）体细胞胚发生早期5个阶段的蛋白质组学研究,为植物胚胎发育相关蛋白基因分离和植物体细胞胚发生相关机制等的深入研究奠定基础。【方法】利用已建立的龙眼体细胞胚发生再生系统,经同步化培养获得龙眼体细胞胚发生早期5个阶段胚性培养物,并采用双向电泳和质谱技术对龙眼体细胞胚发生早期的蛋白质组变化进行分析。【结果】龙眼体细胞胚发生早期5个阶段的蛋白质2D表达谱可检测到1 203-1 798个蛋白点,其在龙眼体细胞胚发生早期各阶段大部分具有阶段差异表达特性,有小部分是阶段特异表达,根据其蛋白数目、表达丰度、分子量和等电点等变化,确定了龙眼体细胞胚发生早期的ECII到CpECGE阶段是体细胞胚发生早期的关键性阶段。成功鉴定45个差异蛋白,成功率为37%,其中以能量、碳水化合物代谢相关蛋白和氧化胁迫反应相关蛋白占多数,分别为22%和27%;通过其功能分析可以推断出,龙眼体细胞胚发生早期,能量和糖代谢是体细胞胚发生的基础,而氧化胁迫反应是体细胞胚发生的先决条件,并通过参与细胞骨架的稳定、氮代谢、信号转导、基因调控、蛋白质的翻译加工修饰和定位等功能的蛋白,构成一个庞大的龙眼体细胞胚发生蛋白质调控网络系统,保证体细胞胚的正常发育。【结论】对龙眼体细胞胚发生早期过程的蛋白质表达变化有了较全面的了解,蛋白质表达数量呈先减低后升高再减低的趋势,龙眼体细胞胚发生早期能量和糖代谢旺盛,氧化胁迫反应相关蛋白对体细胞胚早期的发生和发育有重要的调控作用。     

拟茎点霉侵染对龙眼果实采后果皮褐变和活性氧代谢的影响

 【目的】研究拟茎点霉侵染对龙眼果实采后果皮褐变和活性氧代谢的影响。【方法】采后龙眼果实用拟茎点霉孢子悬浮液（浓度为104个孢子/mL）浸泡接种5 min,以无菌水处理的龙眼果实为对照。经过处理的果实在(28?1)℃、相对湿度90%下贮藏,贮藏期间定期测定果实病害指数、果皮褐变指数、MDA含量、 产生速率、活性氧清除酶（SOD、CAT、APX）活性和内源抗氧化物质（AsA、GSH）含量的变化。【结果】与对照果实相比,拟茎点霉侵染提高了龙眼果实病害指数和果皮褐变指数。同时,拟茎点霉侵染促进龙眼果皮 产生速率增加,且在整个侵染过程维持较高水平;拟茎点霉侵染0—2 d内的果皮GSH含量和APX活性明显下降而SOD和CAT活性快速上升,侵染2—5 d内的果皮APX活性快速上升而SOD和CAT活性快速下降,侵染5 d后的果皮SOD和APX活性快速下降;在整个侵染过程的果皮AsA含量快速下降,而MDA含量增加。【结论】拟茎点霉侵染导致龙眼果皮活性氧清除能力下降而积累大量活性氧,大量的活性氧对细胞膜结构的破坏会引起细胞区室化功能的丧失,使多酚氧化酶与酚类物质接触,其结果引起酚类物质的酶促氧化和黑褐色高聚物的形成而导致龙眼果皮褐变。