农杆菌介导转化蝴蝶兰遗传体系的研究

为建立蝴蝶兰植株的高效遗传转化体系,以蝴蝶兰花梗腋芽诱导的类原球茎体为受体材料,利用农杆菌侵染并在侵染前后辅以超声波及负压处理的方法将gus基因导入到蝴蝶兰中,经过近90 d的筛选,获得了69个抗卡那霉素抗性PLB,经X-gluc组织化学染色法观察检测,表达率最高达39%,并获得了50株再生蝴蝶兰,其中17株PCR检测呈阳性。初步建立了蝴蝶兰遗传转化体系。另外,我们在农杆菌侵染前后辅以超声波及负压处理,可以提高转化效率。     

蝴蝶兰·文心兰遗传转化体系的初步研究

[目的]优化蝴蝶兰和文心兰的遗传转化条件。[方法]以培养3周的蝴蝶兰原球茎和文心兰愈伤组织为试材,以大肠杆菌为生长培养基,研究3种农杆菌菌株的侵染力,以及菌液浓度、侵染时间、酚类诱导物(AS)和共培养时间对转化的影响。[结果]以蝴蝶兰原球茎为农杆菌介导的外植体进行遗传转化的优化条件为:预培养时间3d,菌液侵染浓度OD600=0.3,菌液侵染时间10min,pH值5.4,菌液侵染后,与农杆菌共培养5d并添加100μmol/LAS,此条件下的瞬间表达率最高。将蝴蝶兰遗传转化的条件运用于文心兰,得到的转化率较低。3种农杆菌菌株中,EHA105菌株侵染力最强,其次是AGL1,LBA4404最弱。[结论]该研究为进一步研究蝴蝶兰和文心兰的遗传转化体系提供理论依据。     

农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化体系研究

以铁皮石斛原球茎为受体,研究了农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化体系,对遗传转化中的草甘膦筛选压力,菌液浓度,乙酰丁香酮浓度,预处理方法,侵染时间,美罗培南浓度等转化影响因子进行了优化。结果表明,摁压处理下的原球茎在添加浓度为200μmol·L-1乙酰丁香酮的菌液中侵染30 min,菌液浓度OD600为1.0,共培养48 h后,转入添加质量浓度为50 mg·L-1美罗培南和质量浓度为2.0 mg·L-1的草甘膦筛选培养基中,转化效率最高。经GUS组织化学染色及PCR分析鉴定,初步证明ACC合成酶反义基因已整合到铁皮石斛的基因组中。     

影响农杆菌介导大豆遗传转化的因素

以大豆子叶节为外植体,采用农杆菌介导的遗传转化方法,探讨农杆菌菌液浓度、侵染时间、抗氧化剂、表面活性剂Silwet L-77及草丁膦(PPT)筛选浓度等因素对大豆转化效率的影响。结果表明:适合大豆转化的农杆菌菌液浓度D600nm为0.8,子叶节外植体侵染时间以30min为宜,外植体侵染后在含有25mg·L-1LA共培养基中暗培养3d有利于提高转化效率。此外,PPT筛选的适宜浓度为5mg·L-1。根据大豆子叶节农杆菌转化特点,研究中采用了延迟筛选的方法。     

以蝴蝶兰种子萌发的原球茎为受体的遗传转化体系构建

以蝴蝶兰种子萌发的原球茎为试材,研究了蝴蝶兰遗传转化过程中不同植物生长调节剂、抗生素对蝴蝶兰原球茎增殖和转化效率的影响,并对转基因后代进行了检测。结果表明,适用于蝴蝶兰原球茎的增殖培养基,即蝴蝶兰原球茎遗传转化的共培养培养基配方为:3.0 g/L花宝1号+2.0 g/L活性炭+2.0 g/L水解酪蛋白+15 g/L蔗糖+3.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2,4-D+6.5 g/L琼脂,pH=5.5~5.6;适用于蝴蝶兰遗传转化过程中的筛选培养基配方为:增殖培养基+8.0 mg/L潮霉素+50 mg/L头孢霉素,pH值为5.5~5.6。蝴蝶兰转基因后代的PCR分子检测及GUS活性组织化学检测结果表明,外源基因成功整合到了蝴蝶兰基因组中。     

矮牵牛‘梅林’遗传转化体系的建立

在矮牵牛‘梅林’再生体系基础上,建立根癌农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系,以获得转PSARK-IPT基因的矮牵牛植株。结果表明,转化效率最高的预培养时间为2d,农杆菌侵染浓度为OD600=0.5,侵染时间为3min;共培养时间为36h;适宜的抑菌抗生素头孢霉素浓度为500mg·L~(-1);潮霉素作为遗传转化中的筛选标记,选择2mg·L~(-1)为叶片分化筛选压,4mg·L~(-1)的Hey为最佳生根筛选压。对获得的15株潮霉素抗性植株进行PCR及RT-PCR检测,证明7株为阳性,证实目的基因已整合到这7株矮牵牛基因组中。     

根癌农杆菌介导苹果愈伤组织遗传转化体系的优化

[目的]以'王林'苹果愈伤组织为转化研究的材料,在已经建立的遗传转化基础上,优化根癌农杆菌介导的'王林'愈伤组织的遗传转化系统.[方法]在遗传转化的过程中,通过对根癌农杆菌的侵染时间、共培养以及抗性的选择,优化遗传转化体系并且增加转化效率.[结果]选择生长20 d的愈伤组织,在根癌农杆菌OD600=0.8时侵染20 min,共培养3d、转入卡那霉素30 mg/L和头孢噻肟250 mg/L的培养基上进行筛选,可显著提高遗传转化效率.[结论]将McmiR 399d作为标记基因进行转化,优化苹果'王林'愈伤组织的遗传转化系统,从而得到过表达和沉默的McmiR399d'王林'愈伤组织.     

农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究

利用农杆菌介导玉米愈伤组织遗传转化,研究了不同影响因子对玉米遗传转化效率的影响。结果表明,相比自交系H99,玉米杂交组合H99×A188更适宜作为玉米遗传转化的受体材料;继代6d后的胚性愈伤组织最适宜农杆菌转化;农杆菌菌株EHA105的侵染效果好于EHA101;抗性愈伤组织筛选培养基中除草剂筛选的临界质量浓度为4.0mg/L;头孢霉素质量浓度在500mg/L时适合进行除菌处理,且对植株再生影响较小。     

洋桔梗Double Mariachi Rink高效遗传转化体系的建立

以洋桔梗品种Double Mariachi Pink为供试材料,探讨影响根癌农杆菌介导法遗传转化的一些因素,包括Cb(羧苄青霉素)脱菌浓度、Km(卡那霉素)筛选浓度、农杆菌的侵染浓度和预培养时间等.研究结果表明:脱菌培养基中Cb的浓度为200mg/L时,抑制农杆菌生长但不显著影响叶片不定芽分化;不定芽分化阶段和生根阶段的适宜Km筛选浓度分别为30mg/L和15mg/L;外植体预培养3d,在D600nm≈0.5的农杆菌菌液中侵染10 min后,Km筛选得到的抗性植株GUS染色蓝斑率最高,达到86.7%.     

根癌农杆菌介导地被菊‘紫妍’遗传转化体系的建立

以地被菊‘紫妍’高效再生体系为基础,研究农杆菌介导的地被菊‘紫妍’遗传转化的若干影响因素。结果表明:卡那霉素6、4mg·L-1分别是叶片分化和植株生根的最适筛选质量浓度,同时确定羧苄霉素200mg·L-1是抑制农杆菌生长的最适质量浓度;预培养2d,侵染时菌液OD600约为0.5,侵染时间8min,共培养2d,延迟培养3d有利于提高转化频率。对抗性芽进行生根筛选后,抗性苗提取DNA经过PCR检测初步证明外源基因ClCBF4已整合到地被菊中。移栽出的转基因地被菊全部存活且生长状况良好。