大白菜表达序列标签SSR标记分析*

对大白菜（Brassica campestris L．ssppekinensis）13007个EST序列进行拼接共得到7714个片段重叠群（contig），其中10．4％（890个）非冗余EST含有SSR标记（EST-SSR），标记间平均间隔距离为3．9kb，单、双和三核苷酸重复序列大约各占1／3左右。CDS所包含的三核苷酸重复序列最多，而且AAG／CTT重复序列的含量最高。通过同源性比较分析，获得功能已知的SSR-ESTs774个，共计含有846个SSR，其中50．2％位于5＇-UTR，31．4％位于3＇-UTR，18．4％位于CDS。实验选取123个SSR座位设计引物，利用芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的高抗和高感大白菜F6代自交系材料各2份，分析EST-SSR标记多态性。结果表明，其中37个标记可进行有效扩增，但是没有表现出多态性，23个标记（18．7％）至少在1份材料中具有多态性。对这些EST-SSR标记在大白菜和其它芸薹属植物的系统发育关系分析、遗传作图和基因定位的应用进行了讨论。     

铁皮石斛EST-SSR分子标记的开发

为了开发铁皮石斛EST-SSR分子标记,利用SSRIT软件对铁皮石斛近缘物种-金钗石斛的15 383条EST序列进行SSR位点查找,利用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计和评价,之后经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行初步筛选,并通过聚丙烯酰氨凝胶电泳对所筛选的引物进行有效性检测。结果表明,SSRIT软件共查找到370条SSR位点序列,共有379个SSR位点,候选SSR位点出现的频率为2.46%。二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占41.42%、26.91%和27.44%,其中二核苷酸重复中AG/CT(20.84%)和GA/TC(18.73%)最丰富;三核苷酸重复中TCT/AGA(4.22%)和GA/TC(3.96%)最丰富;而六核苷酸重复基元较多。EST-SSR平均长度为24 bp,平均每8.5条EST序列包含1个SSR位点。设计的106对EST-SSR引物中有50对能扩增出理想的PCR产物,引物有效扩增率为47.17%,其中有43对能够扩增出多态性条带,占可扩增引物的86%。本研究开发的43对引物为铁皮石斛遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建和功能基因研究等提供了重要的参考价值。     

高粱全基因组内含子标记的开发

通过分析已公布的658个随机挑选的SSR标记在12个高粱属材料中的多态性信息,发现基因中内含子标记较非内含子标记有更高的多态性,因此,本研究利用生物信息学方法进行了高粱全基因组内含子标记的开发。首先,对高粱29448条CDS序列进行内含子位点挖掘,找到115545个内含子位点。其次,在内含子两侧的序列上设计引物,经e-PCR在高粱基因组上筛选及定位,共获得82742个单拷贝内含子标记。其在染色体上数量变异范围为3794个（5号染色体）～15371个（1号染色体）之间,平均每条染色体上8237个。此外还构建了1个公共数据库（www.sicau.edu.cn/web/yms/sip/SIP.html）,以便研究人员下载及使用。     

人参EST-SSR标记的建立

从7055条人参EST序列中共搜索出791个SSR。根据引物设计标准,设计了68对EST-SSR引物。在合适的PCR反应体系下,分别以人参品种集安长脖、抚松二马牙的DNA为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,发现有43对EST-SSR引物能扩增出产物。在9个人参品种、2个西洋参品种和2个刺五加品种中进一步对这些可扩增的引物对进行多态性检测,发现有26对引物显示多态性,占可扩增引物的60.47%,占设计引物总数的38.23%。本研究结果表明,根据人参EST建立EST-SSR标记是一种行而有效的的方法。     

致病疫霉基因组微卫星标记开发

致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病是影响马铃薯生产的第一大真菌病害.通过致病疫霉基因组开发微卫星标记,旨为致病疫霉群体遗传结构研究提供更系统、有效的标记.利用软件SciRoKo和ClustalX对致病疫霉基因组中微卫星序列长度≥25 bp的适合标记开发的位点及两端序列进行筛选.然后在这些位点的两端序列上设计专一性PCR扩增引物,选择9株致病疫霉菌对引物的专一性和微卫星的多态性进行检测.最后利用40株不同年份和地理来源的致病疫霉菌株对可行性微卫星标记进行等位基因数的确定及其多态性评估,然后选取部分标记对40株致病疫霉群体进行遗传多样性分析.共获得了33个具多态性的微卫星标记,占开发总数的28.7％,其多态信息含量(PIC)值都在0.164～0.614之间,其中PIC≥0.5的标记有7个,0.25 ＜PIC＜0.5的标记有25个,PIC≤0.25的有1个.发现致病疫霉微卫星基因型与其交配型及地理来源有一定相关性,与甲霜灵敏感性不相关.本研究开发出一批具有多态性微卫星标记,为致病疫霉群体遗传学研究机理提供更多多态性高,稳定性强的分子标记.     

菠菜转录组SSR位点分析及其分子标记的开发

简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)分子标记具有多态性高、重复性好、共显性等特点,己广泛用于蔬菜作物遗传育种研究中.本研究利用MISA软件对菠菜(Spinacia oleracea)转录组SSR位点信息进行分析,开发适用于菠菜的SSR分子标记,并对不同菠菜材料的遗传多样性进行分析.结果显示,在获得的44 796条基因簇(Unigene)中检测出2 045个SSR位点,检测出2 045个SSR位点,分布在1 940条Unigene上,发生频率为4.33％,平均距离为19.81 kb.菠菜SSR中以单、三、四核苷酸重复为主,分别占总SSR的19％、65％和7％,重复长度主要为18～24 bp,占菠菜总SSR的93.55％,以重复次数6次和7次为主,分别占菠菜总SSR的31.42％和31.05％.菠菜转录组中单核苷酸重复类型为A/T,二核苷酸重复主要为GA/TC和AG/CT,三核苷酸重复主要以CAA/TTG、GTT/AAC、GAA/TTC、TGT/ACA和GAT/ATC为主.本研究共设计了2 199对SSR特异位点引物,随机挑选218对引物对9个不同类型的菠菜材料进行扩增检测,其中38对表现出多态性.利用UPGMA做图进行聚类分析,9份菠菜材料聚为3类.本研究通过对菠菜转录组SSR位点信息分析及其分子标记的开发,获得了多态性较为丰富的SSR位点,为菠菜遗传多样性的分析、遗传图谱的构建及分子标记辅助育种提供了基础资料.     

用SSR标记对水稻品种的分类研究

用20对SSR引物对培矮64s、N422s、108s、LS2s等4个不育系和55份严自不同生态型的恢复系进行分类研究，结果表明：供试材料DNA籼粳分化明显，聚类分析结果和用RFLP对供试材料的籼粳分化明显。聚类分析结果和用RFLP对供试材料的籼粳分类结果基本一致，而且者与形态分类的结果也基本一致，在所用的20对SSR引物中，有5对是籼粳特异的，其灿粳分辨率均在90％以上。     

植物EST-SSR标记开发及其应用

随着生物科技的进步,大量的植物表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）已经成为开发SSR标记的重要资源。EST-SSR作为一种新型分子标记,其多态性可能与基因功能直接相关,而且在相近植物间具有良好通用性,使得EST-SSR标记在实际应用中更具价值。采用计算机方法大规模发掘EST-SSR多态性位点极大地提高了SSR标记开发效率。尤其随着新一代测序技术的成熟以及测序成本的急剧下降,利用新一代测序技术产生大量的转录组数据进行EST-SSR多态性标记的计算机大规模发掘将对SSR标记的开发带来深远影响。本文简要介绍了植物EST-SSR分布特点,并对EST-SSR标记开发现状以及相关应用作了综合评述,此外,还对EST-SSR标记的计算机开发新策略进行了展望。     

SSR分子标记与玉米杂种优势关系的研究

选择较为均匀地分布于玉米（Zea mays)10对染色体上的71对SSR引物，在17个自交系间共检测出384个等位基因变异，每对引物检出2－12个等位基因，平均为5．4个，每个SSR位点的多态信息量（PIC）变化于0．278－0．896之间，平均为0．672。利用384个多态性SSR标记位点计算了17个自交系之间的遗传相似系数（GS），其范围在0．681－0．873之间，平均为0．740。以SSR标记遗传相似系为原始数据，按UPGMA方法对17个自交系进行聚类分析，以相似系数0．750为标准，可将17个自交系分为6类，聚类结果和已知系谱关系十分吻合。根据直线相关分析，自交系间SSR分子标记遗传距离与产量及杂种优质相关极显著，但相关系数较小，分别为0．443和0．310。分群后进行的相关分析表明，遗传距离与产量以及遗传距离与杂种优势的相关系数分别提高到0．682和0．609，均达到极显著水平。因此，合理分类，并选择合适的自交系配制组合，可避免群内自交系间杂交，减少育种的盲目性和工作量。     

遗传图谱构建时标记的选择与表达序列标签

表达序列标签(EST)是一种快速有效揭示基因组容量的方法。ESTs在新基因的发现、基因作图和基因组序列编码区域的确定等方面起到重要作用。综述了遗传图谱构建时标记选择及EST的应用。     

不同核桃农林复合经营模式对土壤肥力的影响

为了解复合经营对核桃园土壤肥力的影响,在贵州省威宁县核桃主产区选取了3种具有代表性核桃复合经营模式,即核桃-白三叶(J+T)、核桃-大豆(J+S)和核桃-玉米(J+M),以核桃清耕为对照(CK),4年后对4种核桃经营模式0~20 cm,20~40 cm,40~60 cm土层土壤肥力进行分析。结果表明:与核桃清耕模式相比,三种核桃复合经营模式均降低了土壤p H值,提高了土壤有机质、全氮、有效氮、全磷、有效磷、全钾和有效钾等;四种核桃经营模式土壤p H值均随土层深度增加而增大,土壤有机质、全氮、有效氮、全磷、有效磷、全钾和有效钾等均随深度增加而减少;三种复合经营模式土壤p H值大小依次是核桃-大豆模式核桃-白三叶模式核桃-玉米模式;三种复合经营模式土壤有机质、全氮、有效氮、全磷、有效磷、全钾和有效钾等含量高低均表现为核桃-玉米模式核桃-白三叶模式核桃-大豆模式。说明复合经营可以改善核桃园土壤肥力,且四种模式间的土壤肥力差异主要是由不同施肥量引起的。     

Regulation of aflatoxin production by naphthoquinones of walnut (Juglans regia)

Walnuts are a valuable crop the sale and export potential of which may be severely limited by contamination with aflatoxins, metabolites produced on infection with Aspergillus flavus. The effect of a series of four naphthoquinones [1,4-naphthoquinone (1); juglone (5-hydroxy-1,4-naphthoquinone) (2); 2-methyl-1, 4-naphthoquinone (3); and, plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1, 4-naphthoquinone) (4)] (Figure 1), which occur in walnut husks, on fungal viability and aflatoxigenesis was studied in vitro. The quinones delayed germination of the fungus and were capable of completely inhibiting growth at higher concentrations. Their effect on aflatoxin levels was highly dependent on the concentration of individual naphthoquinones in the media. At higher concentrations, aflatoxin production was decreased or completely inhibited, but at lower concentrations there was a stimulatory effect on aflatoxin biosynthesis, with a >3-fold increase at 20 ppm of 3. Structural features associated with decreased fungal viability and greatest effect on aflatoxigenesis are the presence of a 5-hydroxyl or 2-methyl substituent, but there is no significant additive effect when both of these substituents are present.     

厚朴转录组特征分析及EST-SSR标记的开发

为探明厚朴的基因组信息,开发合适的生物学工具以促进厚朴的遗传育种,本研究利用Illumina-Solexa测序技术对厚朴根、茎皮、叶不同组织的9个样本进行转录组分析,获得大量的序列信息,并以转录组序列为基础进行厚朴SSR分子标记的大规模发掘。结果表明,共获得了109 526条厚朴转录组序列,平均序列长度为1 023 bp,通过与蛋白数据库NR、Swiss-Prot、GO、KOG和KEGG五个数据库比对,分别有6 0361、39 942、65 535、51 351和27 310条厚朴转录组的Unigene被注释;厚朴转录组表达信息进行大通量SSR位点的发掘,发现了含SSR位点的序列25 925条,共27 721个SSR位点,SSR出现的频率为23.67%。厚朴转录组共发现了374种碱基重复模式,且CT/GA和AG/TC是主要的双碱基重复序列,AGA/TCT和AAG/TTC是主要的三碱基重复序列;随机挑选的180对SSR引物中有104对产生清晰可重复的条带,21对引物具有多态性,厚朴SSR引物多态性较高。本研究结果为厚朴及近缘种的遗传多样性分析、遗传图谱构建及比较基因组研究奠定了一定的理论基础。     

基于光谱特征参量的核桃叶片氮素含量估测模型

建立基于光谱特征参量的新温185号(Juglans regia‘Xinwen185’)核桃叶片氮素含量估测模型,旨在为快速监测新温185号核桃叶片N素营养状况提供技术途径。基于肥料效应田间试验,测定N肥不同施用量水平下新温185号核桃果实坐果期、速生生长期、脂化期和近成熟期的叶片光谱反射率和N素含量,采用Pearson相关分析方法筛选与叶片N素含量呈极显著相关的光谱特征参量,并应用回归分析方法建立叶片N素含量光谱特征参量估测模型。结果表明:与叶片N素含量呈极显著相关(P0.01)的光谱特征参量在果实坐果期有绿峰反射率和红色比值指数,在果实速生生长期有黄边位置、红谷反射率和绿色比值指数、红色比值指数、绿色归一化差值指数、红色归一化差值指数,在果实脂化期有绿峰反射率和红色比值指数,在果实近成熟期有绿峰反射率、黄边幅值和红边面积。分别以绿峰反射率、黄边位置、红色比值指数和黄边幅值为自变量采用三次函数建立的果实坐果期、速生生长期、脂化期和近成熟期叶片N素含量回归估测模型的拟合度R2均在0.99以上,且模型具有很好的稳定性和很高的估测精度。表明可采用三次函数建立果实不同生育时期叶片N素含量光谱特征参量估测模型对新温185号核桃树体N素营养水平进行监测。光谱技术在核桃树体N素营养信息探测方面有较大的应用潜力。     

Exploring low-chill genotypes of Persian walnut (Juglans regia L.) in west of Iran

Genetic Resources and Crop Evolution - Climate change may cause a significant decline in winter chill over the coming decades and is becoming an important issue for walnut (Juglans regia L.)...     

Phytochemical inhibition of aflatoxigenicity in Aspergillus flavus by constituents of walnut (Juglans regia)

Tulare walnut, a cultivar highly resistant to aflatoxin formation, was investigated for endogenous phytochemical constituents capable of inhibiting aflatoxigenesis in Aspergillus flavus. The activity, located entirely in the pellicle (seed coat), was extractable to various degrees with polar solvents, although some activity remained unextractable, indicating that the bioactivity resided in a complex of hydrolyzable tannins. These tannins can be hydrolyzed by a fungal tannase present in A. flavus, yielding gallic acid and ellagic acid, testing of which showed that only gallic acid had potent inhibitory activity toward aflatoxin biosynthesis. Comparison of the gallic and ellagic acid content in the pellicle of Tulare and Chico cultivars, over the 2002 and 2003 growing seasons, showed that the gallic acid content increased rapidly with maturation of the nut and was 1.5-2 times higher in Tulare than in Chico. Gallic acid content in the pellicle at maturity of a series of commercial English walnut cultivars, and two black walnut species, was determined as an indicator of potential for inhibition of aflatoxigenesis. Regulation of gallic acid levels in the hydrolyzable tannins of walnuts by conventional breeding or genetic manipulation has the potential to provide new cultivars with high resistance to aflatoxigenesis.     

利用SSR及EST标记对鲤鱼饲料转化率的QTL分析

利用137个SSR(simplc sequence repeat)及EST(expressed sequence tag)标记,对柏氏鲤(Cyprinus pelle grini)/荷包红鲤(Cyprinus carpio wuyuanensis)抗寒品系的BC1F1群体93个个体进行了基因型检测.利用Windows Map Manager2.0的标记回归法进行了饲料转化率数量性状单标记回归分析.检测结果得到了8个微卫星标记(HLJ133、HLJ360、HLJ380、HLJ562、HLJ740、HLJ852、HLJ930和HLJ1420)和2个EST标记(HLJE318和HLJE417)与鲤鱼饲料转化率相关,对性状的表型贡献率为4%～11%.对同一标记的不同基因型间饲料转化率性状进行了显著性比较,通过ANOVA检验找到了相关基因型,标记HLJ360、HLJ380、HLJ562座位上,分别对应基因型212/212、236/224、220/220与饲料转化率性状正相关.本研究检测出的与鲤鱼饲料转化率性状相关的标记及基因型,为鲤鱼的QTL定位及分子标记辅助育种(MAS)提供了有效的依据.     

Phenolic acids, syringaldehyde, and juglone in fruits of different cultivars of Juglans regia L

Phenolic acids (chlorogenic, caffeic, p-coumaric, ferulic, sinapic, ellagic, and syringic acid) as well as syringaldehyde and juglone were identified in ripe fruits of 10 walnut cultivars: Adams, Cisco, Chandler, Franquette, Lara, Fernor, Fernette, Alsoszentivani 117 (A-117), Rasna, and Elit. Analyses were done using a high-performance liquid chromatograph equipped with a diode array detector. Significant differences in the contents of identified phenolics were observed among cultivars. Phenolics were determined separately in the kernel and in the thin skin of the walnut, termed the pellicle. Not only in the kernel but also in the pellicle did syringic acid, juglone, and ellagic acid predominate (average values of 33.83, 11.75, and 5.90 mg/100 g of kernel; and 1003.24, 317.90, and 128.98 mg/100 g of pellicle, respectively), and the contents of ferulic and sinapic acid (average values of 0.06 and 0.05 mg/100 g of kernel and 2.93 and 2.17 mg/100 g of pellicle, respectively) were the lowest in all cultivars. The highest differences in the sum of all identified phenolics were observed between Rasna and Fernette fruits; in Rasna there were >2-fold higher contents of identified phenolics in both kernel and pellicle. It was found that the walnut pellicle is the most important source of walnut phenolics. The ratio between the contents in pellicle and kernel varied by at least 14.8-fold for caffeic acid (cv. Adams) and by up to 752.0-fold for p-coumaric acid (cv. Elit).