禽流感、新城疫可目视化诊断蛋白芯片的制备及初步应用

超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了2种病毒蛋白抗原，用点样缓冲液稀释后点于醛基修饰的片基上．制备蛋白芯片；将芯片与待检血清杂交后，再与胶体金标记的二抗杂交，银染显色后根据灰度值判定结果，从而建立了2种禽病的可视化蛋白芯片鉴别诊断方法。采用该方法对18份现地血清样品进行初步检测，结果显示该芯片可特异性的与相应的抗体杂交，无交叉反应，而且呈现较强的杂交信号，其信号灰度值在阳性血清浓度为50－300微克／毫升范围内成线性关系（Y=0．426X＋4．225）。     

禽流感病毒NP基因的真核表达及抗体检测芯片的建立

为建立一种检测A型禽流感病毒(AIV)抗体的蛋白芯片,本研究以AIV总RNA为模板,RT-PCR方法扩增NP基因,与真核表达载体pFastBacHTa连接,并在昆虫细胞中表达.重组蛋白经纯化及western blot鉴定,点样于醛基包被的载玻片上,制备检测AIV抗体的蛋白芯片.确定芯片反应最佳条件为:点样浓度2 mg/mL,固定24 h,1%BSA进行封闭,一抗稀释度1:100,二抗稀释度1:2000.利用蛋白芯片分别对15个亚型流感病毒免疫血清、SPF鸡血清、抗新城疫病毒血清、抗法氏囊病毒血清和现地血清样品进行检测,通过与血凝抑制试验比较,表明建立的蛋白芯片方法具有良好的灵敏性和特异性,为AIV抗体检测及制备检测AIV不同亚型或多种病原抗体的蛋白芯片提供方法.     

内源和外源性禽白血病病毒鉴别PCR检测方法的建立

为建立简单快捷的内、外源性禽白血病病毒(ALV)的鉴别检测方法,本研究根据外源性ALVA亚群标准株RAV-1的p27、env基因以及内源性ALVE亚群标准株ev1的env基因的保守序列,设计3对特异性引物,可分别对ALV、外源性ALV(A、B亚群)和内源性ALV(E、J亚群)进行扩增,扩增产物分别为793bp、387bp和234bp,通过对各反应条件的优化建立了同时检测并鉴别内、外源性ALV的多重PCR方法。该方法特异性良好、灵敏度可达到2×103copies,利用该方法和ELISA对5份现地病鸡组织样品和10枚疑似感染内源性ALV的鸡胚进行检测,结果表明:4份病鸡样品均扩增出3条特异性片段;而9枚鸡胚仅扩增出793bp和234bp的特异性片段,2种检测方法的符合率为100%。该方法为内、外源性ALV的临床鉴别诊断奠定了基础。     

纸膜免疫金银染色诊断鸡马立克氏病的研究

本研究建立了纸膜兔疫金银染色法(P—IGSS)诊断鸡马立克氏病(MD)。以定量滤纸为载体,既可检测抗原,又可检测抗体。检测抗原的灵敏度为0.39μg/点,检测抗体的灵敏度为1.4μg/点。450份鸡血清P—IGSS和琼脂扩散试验(AGP)检出率分别为42.44%和37.78%,30份接种MD病鸡羽髓抗原检出率分别为96.67%和90%。3次重复试验重复率达100%。2批金标抗体检测结果一致。与9种鸡传染病阳性血清和3种鸡传染病抗原不发生交叉反应。用本法3小时内可报告结果,而AGP需24—72小时,试验结果表明该方法用于MD诊断是可靠的。     

鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测鸭坦布苏病毒(DTV)的血清学方法,本研究利用纯化的DTV奉贤株(FX2010)作为包被抗原,建立了检测DTV血清抗体的间接ELISA方法,并且对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最适包被浓度为1.675μg/孔,抗原最佳包被条件为37℃放置2 h后,4℃下过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.432。用建立的间接ELISA方法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为2.9%和3.9%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接ELISA方法对140份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,有108份样品呈现阳性,而琼扩试验只有32份呈阳性结果,而且用该方法检测的阳性样品包括了琼扩试验的阳性样品,证明该方法具有较高的敏感性和特异性。本研究快速检测DTV抗体间接ELISA的建立为该病的诊断和流行病学调查提供了新的方法。     

布鲁氏菌BP26抗体iELISA检测方法建立

将布鲁氏菌BP26蛋白基因克隆入pET-28a原核表达载体,经表达、纯化后进行Western blot分析。以该蛋白为包被抗原,建立布鲁氏菌BP26抗体iELISA检测方法,并进行特异性、敏感性、符合率等试验。结果表明:成功构建重组原核表达载体pET28a-BP26,表达和纯化后获得目的蛋白浓度为680μg/mL,Western blot显示与牛和羊血清均具有良好的免疫学活性;建立并优化了BP26抗体iELISA检测方法,抗原包被浓度为13.6μg/mL、血清稀释倍数为1∶100、封闭条件为1.5%乳清蛋白、37℃1 h,二抗稀释倍数为1:2000,37°显色15 min;用建立的iELISA检测方法与传统虎红平板凝集试验比较,413份羊血清样品的符合率为92.2%,186份牛血清样品的符合率为94.8%。该方法可大规模应用于临床牛和羊血清样品检测,为布鲁氏菌病抗体监测及净化提供技术支持。     

不对称RT-PCR结合芯片技术鉴别4种禽病的初步研究

本研究结合非对称RT-PCR和基因芯片两种技术,构建可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型和N1、N2神经氨酸酶亚型以及鸡传染性支气管炎病、新城疫病、鸡传染性法氏囊病的基因芯片。分别T／A克隆部分禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因,鸡传染性支气管炎病毒np基因、新城疫病np基因、鸡传染性法氏囊A基因,并构建重组质粒;以重组质粒为模板,用PCR方法扩增制备探针,纯化后点于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;常规方法从待检样品中提取RNA,用Cy3标记引物进行RT-PCR,将荧光素引入PCR产物中;并对扩增条件进行优化。研究发现检测探针可特异性的与相应的标记样品进行杂交,呈现较强的杂交信号;该方法可以准确进行4种主要禽病的鉴别诊断和禽流感主要流行亚型鉴定,对感染样品和现地样品检测结果与RT．PCR、鸡胚接种有较高一致性,符合率分别为100％和96％。结果显示该方法可用于同步鉴别禽流感、鸡传染性支气管炎、新城疫、鸡传染性法氏囊病,以及现地主要流行的禽流感亚型,是一种有效的新方法。     

J亚群禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

本研究利用J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)gp85单因子血清纯化后的抗体成功建立了检测ALV-J抗原的双抗体夹心ELISA方法(DAS-ELISA)。结果表明,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,对ALV-J抗原的最小检出量为0.165 μg/mL。用该法对48份临床血浆样品进行检测,结果与PCR方法的符合率达到85.2%。     

应用寡核苷酸芯片检测猪口蹄疫病毒的初步研究

本研究根据口蹄疫病毒(FM DV)基因组序列保守区,设计合成2对引物,通过RT-PCR方法筛选出特异引物,用Cy3标记下游引物5′端;针对这个基因片段,设计合成4条寡核苷酸探针,开展靶基因扩增和克隆、阳性质粒构建、芯片杂交与反应条件优化以及芯片灵敏度和特异性分析等试验研究,建立FM DV的基因芯片检测方法,同时应用该芯片检测了现地标本39份,证明该芯片的灵敏度高、特异性好,可以准确检测出猪口蹄疫病毒,为建立猪病基因芯片诊断技术平台奠定基础。     

安徽省部分地区禽波氏杆菌病的血清学调查

从2006～2007年对安徽合肥、六安、巢湖、安庆、淮南、阜阳、滁州、芜湖、蚌埠等9个地区的163群禽中出现拉稀的病禽采取血清样品326份,进行波氏杆菌病抗体检测.结果,在326份禽血清样品中检出阳性79份,阳性率为24.23%,并对不同品种、日龄、地区的禽波氏杆菌病的感染率进行统计.统计表明,禽波氏杆菌病在安徽部分地区的禽群中流行相当严重.     

Disease and destiny-mystery and mastery

When early people made their appearance, zoonotic infectious diseases were already waiting, but epidemic diseases did not appear in human history until people began to live in large numbers under conditions of close contact, mainly during the last 10,000 years. Disease has decimated urban populations, conquered armies, and disrupted society. The focus here is on (1) the plague of Athens and the Black Death; (2) smallpox, influenza, and rabies; (3) avian influenza prion diseases, and foot & mouth disease; and (4) emerging and re-emerging diseases. All have veterinary public health associations. In Athens, Greece, in 430 BC, when the Spartans ravaged the countryside, hordes crowded into Athens so that orderly movements, space in which to live, and adequate supplies of food became impossible. Crowding of any population fosters disease transmission; chaos and disorder enhance it all the more. Out of northern Egypt came a terrible plague from across the Mediterranean Sea. The identity of the plague of Athens remains unsure, but the well-considered conclusion is Rift Valley Fever, a mosquito borne, viral zoonosis. The Black Death, also called the Plague, raged in Asia for centuries. In 1347, the Black Death was brought by a ship out of Asia to Sicily. The scenes of devastation were repeated throughout Europe, with 90% or more of the people dying in city after city. Influenza, too, has been a cause of periodic human epidemics, but the great pandemic of influenza occurred in the last months of World War I. In the years of highest occurrence, more than half the world's population became clinically infected. If veterinary public health had been born earlier, it could have led to elucidating the epidemiology of influenza and the plagues of Athens, Europe, and Asia. In turn, smallpox had also caused continual tragedy. In 1796, Edward Jenner began to harvest pustules of cowpox from children or infected cows and inject them into susceptible children. In 1980, the World Health Organization declared that smallpox had been eliminated from the world. Rabies, though, still strikes terror. A number of animal diseases, broadly termed emerging and re-emerging diseases, need surveillance because they have the potential to impact human health. From late in 2003 to 2007, the highly pathogenic H5N1 influenza virus in poultry infected at least 121 people and caused 62 deaths in four countries. The prion diseases, too, all have very high numbers in concentrated contacts. To control these diseases, veterinary public health is essential, with diagnosis, epidemiological surveillance, clinical manifestations, and prevention as primary measures.     

Foot and mouth disease and bluetongue: differences and similarities

On 26th of july 2007 a new case of bluetongue was notified in the Netherlands and on 2nd of august 2007 foot-and-mouth disease was diagnosed in Surrey, England, which raised the threat of having both infections simultaniously in one area. Bluetongue and foot-and-mouth disease have a different pathogenesis, but symptoms may resemble each other at a later stage of infection. The pathogenesis and possible clinical symptoms of both infections are discussed and illustrated with pictures.     

德国荷兰畜禽产品质量安全交流与启示

2018年岁末,笔者有幸赴德国和荷兰,就畜产品质量安全控制及检测技术等进行了短期交流,收获颇丰,现具体介绍如下。一、交流情况德国面积35.73万平方千米,人口约8175.2万,是欧盟人口最多的国家,农业发达,机械化程度很高。德国的畜牧业以猪、牛、羊和禽类为主,畜牧业产值占农业生产总值的61%。德国虽然农业比重很小,但却是有机农业运动最早的发起国,也是目前世界上有机农产品生产与消费大国。     

奶牛肢蹄病及其防治

简介常见奶牛肢蹄病种类及其症状,从日粮营养、运动场地面结构、环境卫生、饲养管理、遗传育种、疾病管理等方面简析奶牛肢蹄病的病因,并提出相应的预防措施。     

畜禽物种多样性及其保护和利用

文章就我国畜禽物种多样性资源的现状、保护和利用等方面进行阐述,为生态脆弱的喀斯特地区畜牧业可持续发展提供参考。     

马的咽气癖及其防制措施研究进展

在动物的异常行为中以刻板行为最为常见,而咽气癖又是马最常见的口部刻板行为之一。作者就咽气癖在生理方面和心智方面对马体产生的影响、行为基础、诱因的研究进展及常见的防治措施进行综述。     

牛羊焦虫病诊断与防治技术

近几年来,辽宁省牛羊饲养业迅速发展,焦虫病的危害越来越明显,已成为危害牛羊的主要疾病之一。为了提高牛羊焦虫病的防治水平,保证我省牛羊饲养业的健康发展,笔者在参阅文献和同行们诊疗经验的基础上,结合自己的治疗实践,详细阐述了我省牛羊焦虫病近几年的流行特点和诊断防治方法。     

国内外蛋氨酸与赖氨酸市场分析与展望

近几年,世界饲用添加剂市场增长较快,预计今后将进一步增长,据世界粮农组织(FAO)首领会议的倡议,到2015年,将使世界营养不良的人口削减一半,其间,肉制品将会以每年2％的速度增长,特别是加快猪肉和禽肉增长。这将促进世界添加剂,尤其是蛋氨酸和赖氨酸需求量的增加。