苹果褪绿叶斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

【目的】为了制备苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的抗血清,【方法】将ACLSV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV和pEHISEGFPTEV,转化大肠杆菌Rosetta,切胶回收诱导表达的CP融合蛋白免疫新西兰长耳兔,制备ACLSV的抗血清。【结果】利用原核表达载体pEHISTEV和pE-HISEGFPTEV在Rosetta中分别表达出了分子质量为25 ku和55 ku的ACLSV CP融合蛋白。切胶回收25 ku的融合蛋白免疫新西兰长耳兔。经ELISA测定,所制备的抗血清效价为1∶1 024,Western blot及组织印迹分析表明抗血清能与ACLSV CP发生特异性的免疫反应。【结论】该血清特异性强,效价高,可用于苹果叶片、果实和枝条等样品中A-CLSV的检测。     

苹果褪绿叶斑病毒PBM1毒株的提纯,抗血清制备研究总结

从木本植物上分离出的苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus)的PBM_1毒株能引起李品种“Hauszwetshe”的假痘病症状,将该毒株接种到昆诺藜上繁殖,感染PBM_1毒株的昆诺藜叶片用两次冻融蔗糖梯度离心提纯,每100g叶片的病毒含量平均为1.68mg。提纯的病毒溶液在电镜下可以观察到弯曲状病毒颗粒上的螺纹结构。通过SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,该病毒外壳蛋白的分子量21.5道尔顿。提纯的病毒免疫家兔制备的抗血清,用ELISA法检测感染PBM_1的昆诺藜叶片和桃花,检测效果很灵敏。     

苹果属植物对褪绿叶斑病毒（CLSV）的抗性鉴定

该文以变叶海棠为砧木研究了２６个种类的苹果属植物对褪绿叶斑病毒（ＣＬＳＶ）侵染后的反应。试验结果表明,受ＳＬＣＶ分染后,２６个种类的苹果属植物嫁接成活率降低,生长量减少,胺接相对成活率的变化与植物的带毒量有极显著的负相关９ｒ＝－０．９３６１＾＊＊）。对砧木和接穗粗度影响不大,对株高影响明显,其变化与其植株的带毒量有显著的正相关（ｒ＝０．８０４８＾＊＊）。叶片叶绿素含量降低,叶录素成份ａ／ｂ比值升高     

中,西药剂在苹果褪绿叶斑病毒脱除中的应用

以鉴定明确带有褪绿叶斑病毒的新红星试管苗为试材。在培养基中分别加入南板兰根和三氮唑核苷，接入大（５ｍｍ）、小（０．５ｍｍ）两种茎尖。分化后，经一次继代，进行ＥＬＩＳＡ检测。结果南板兰根对茎尖分化略有抑制，但其浓度高低没有影响；三氮唑核苷对分化有抑制作用，浓度越高越强，因此应在低浓度下使用。两种药剂均对大茎尖的分化没有影响。经ＥＬＩＳＡ检测，南板兰根只在高浓度（４支／Ｌ）、较小茎尖时（０．５ｍｍ）．对褪绿叶斑病毒有脱除作用。而三氮唑核苷在本试验中不论浓度高低（１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ）和茎尖大小（０．５ｍｍ，５ｍｍ），对褪绿叶斑病毒均有很好的脱除作用。     

核果类果树苹果褪绿叶斑病毒的研究

１９９６和１９９７年春天，利用ＰＡＳ—ＥＬＩＳＡ检测方法，对昌黎等地区１９个品种２６２株桃树，３个品种４２株李树和３个品种１４株甜樱桃树的苹果褪绿叶斑病毒进行了检测，结果表明，桃树总感染株率高达６０．３％；李树和甜樱桃的感染率分别为７１．４％和４７．１％。不同品种之间感染株率存在着明显差异。     

苹果褪绿叶斑病毒的特性与为害

目前,世界各地报道的苹果病毒病害有40余种。其中,苹果褪绿叶病毒最重。现将该病毒的危害性及研究进展情况综述如下。供爱好者参考。一、苹果褪绿叶斑病毒的危害概况及病状     

苹果属植物对苹果褪绿叶斑病毒病的抗性

毒原Ｐ２０４双芽嫁接接种苹果褪绿叶斑病对所用试材都能进行有效侵染。试验表明，苹果属植物受ＣＬＳＶ侵染后，过氧化物酶活性及同工酶都产生显著变化，并且相对酶活性的大小及同工酶的变化与植株对ＣＬＳＶ抗性的强弱显著相关；受侵染后新酶带的出现不是新酶成分的产生，只是由于病毒的侵染诱发酶蛋白的提前合成。试验初步发现所用试材中河南海棠、丽江山定子、小金海棠抗性相对较强；垂丝海棠、锡金海棠抗性较弱；扁果海棠、森林     

苹果褪绿叶斑病毒在苹果植株体内的分布

以采自河北农业大学苹果园的褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)样本为试材,采用实时荧光定量RT-PCR方法,研究了苹果不同组织部位、不同树体方位、不同生长发育时期和病毒相对含量之间的关系,以期为明确褪绿叶斑病毒在苹果植株中的时空分布规律提供参考依据。结果表明:从组织部位角度分析,在苹果的盛花期,ACLSV在花中的相对含量最高,芽中最低,ACLSV相对含量由高到低依次为:花、二年生枝皮组织、叶、一年生枝皮组织和芽。从树体方位角度分析,在苹果一年生枝皮组织中,ACLSV在4个方位上的病毒相对含量差异显著,位于南向的病毒相对含量最高,西向最低。从生长发育时期角度进行分析,2015年9月至2016年4月,苹果一年生枝皮组织中,病毒相对含量从9月中旬至10月中旬大幅升高,10月中旬达到这8个月中的最高峰,此后病毒相对含量开始下降,3月起呈上升趋势。     

苹果属植物对苹果褪绿叶斑病毒病的抗性

毒原P204双芽嫁接接种苹果褪绿叶斑病毒(Apple Chlortic Leaf Spot Virus),对所用试材都能进行有效浸染.试验表明,苹果属植物受CLSV浸染后,过氧化物酶活性及同工酶都产生显著变化,并且相对酶活性的大小及同工酶的变化与植株对CLSV抗性的强弱显著相关;受侵染后新酶带的出现不是新酶成分的产生,只是由于病毒的侵染诱发酶蛋白的提前合成.试验初步发现所用试材中河南海棠、丽江山定子、小金海棠抗性相对较强;垂丝海棠、锡金海棠抗性较弱;扁果海棠、森林苹果R12740—7A、湖北海棠、三叶海棠则甚敏感.     

梨组织中苹果褪绿叶斑病毒的原位RT-PCR检测

 为了建立梨树苹果褪绿叶斑病毒原位RT-PCR检测技术, 用已知带有苹果褪绿叶斑病毒的库尔勒香梨和无病毒实生苗叶片为材料, 利用D IG标记, 研究了香梨病毒的叶片石蜡切片IS-RT-PCR检测技术。包括AMV逆转录酶、dNTPs、RNasin及互补引物浓度对cDNA合成的影响, 退火温度、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺ 、引物浓度及循环次数对原位PCR效果的影响。结果表明: RNasin的用量大于0.2 U·μL^-1时,信号强度随着RNasin量的加大而增强; 只有当dNTPs浓度达1.0 mmol·L^-1时才能生成一定量的cDNA;AMV浓度在0.3～0.5 U·μL^-1均可进行正常的逆转录, 而且在该范围内产物的量随AMV浓度提高而增多; 引物浓度达到0.9μmol·L^-1以上时才能进行有效的逆转录, 并且生成的cDNA的量随引物浓度增大而增加。原位扩增ACLSV的cDNA适合退火温度为56℃。循环20～30次可出现较强的蓝色信号, 引物浓度在0.8～1.2μmol·L^-1时显色较好; Taq酶浓度为20 U·mL^-1以上, 均显示较深的蓝色; Mg^{2 +}浓度为1.5mmol·L^-1就可满足原位PCR所需。获得了苹果褪绿叶斑病毒的原位PCR优化检测体系, 利用建立的优化程序对香梨样品进行了检测验证, 取得了很好效果。     

山楂属植物中苹果褪绿叶斑病毒的RT-PCR检测及病毒脱除方法

【目的】建立优化的山楂属植物苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的RT-PCR检测体系,获得以山楂组培苗为试材的高效ACLSV脱除方法。【方法】基于转录组高通量测序解析的山楂属植物ACLSV基因组序列设计病毒检测引物,比较c DNA模板浓度、Taq DNA聚合酶种类及采样部位对病毒RT-PCR检测效果的影响。通过组培苗热处理和培养基中添加三氮唑核苷来脱除山楂植株中的ACLSV。【结果】基于转录组高通量测序获得的2个ACLSV山楂分离物的全基因组序列设计并筛选出适合于山楂属植物ACLSV的RT-PCR检测引物。建立了优化的山楂属植物ACLSV的RT-PCR检测体系。对80份山楂样品进行病毒检测,其中有18个样本检测出ACLSV,带毒率为22.5%。比较了热处理(37℃、30d)、化学处理(培养基中添加20 mg·L-1的三氮唑核苷,处理40 d)、热处理与化学处理结合方法(处理30 d)3种方法对山楂组培苗中ACLSV的脱除效率,表明热处理或热处理与化学处理结合的方法能够完全脱除山楂中的ACLSV,而单独化学处理的脱毒率不能达到100%。【结论】建立了优化的山楂属植物ACLSV的RT-PCR检测体系,表明组培苗热处理是脱除山楂植株中ACLSV的有效方法。     

苹果退绿叶斑病毒组织印迹的免疫法检测与定位

用组织培养技术将富士苹果茎尖外植体建立在ＭＳ培养基中,形成试管苗。取４—６周龄的茎与愈伤组织,徒手切取约１ｍｍ厚的横切面,印迹在硝化纤维膜上。印迹组织经封闭后,与ＣＬＳＶ碱性磷酸酶标抗体反应。对反应结果进行显色。感染ＣＬＳＶ的印迹组织呈紫色反应,正常组织无显色反应。结果表明,该方法十分容易检测印迹组织中的ＣＬＳＶ。带毒愈伤组织较茎的显色反应敏感,显色反应时间仅为茎的一半（１５ｍｉｎ）。ＣＬＳＶ在愈伤组织中有两种分布情况：一是所有组织均有显色反应;二是呈不均匀分布。ＣＬＳＶ在茎组织中有三种分布情况：第一,除髓部外,表皮、皮层及维管系统中均有分布;第二,不均匀分布,ＣＬＳＶ集中分布于表度组织中,在皮层及韧皮部仅有少量分布;第三,“嵌合”分布,即同一种组织中部分组织带毒,部分为正常组织。     

梨叶片中苹果褪绿叶斑病毒的引物原位标记检测

 选用带苹果褪绿叶斑病毒的香梨叶片,制备成适合进行原位RT-PCR的石蜡切片。设计特异引物,利用引物原位标记技术对切片组织中的病毒进行了检测研究,结果表明,PRINS-FITC染色法和PRINS-Rhodamine染色法均能获得良好的检测效果,有病毒部位分别显示绿色荧光和红色荧光,而且荧光出现的位置与原位RT-PCR检测的结果一致。由此证明引物原位标记技术可用于果树病毒的原位检测。     

瓜类褪绿黄化病毒p22 基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 以被瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）侵染的甜瓜叶片为供试材 料,采用RT-PCR 方法克隆其P22 蛋白基因,并将其连接到原核表达载体pGex-4T-3 上,PCR 验证及克隆 测序确定开放阅读框的正确性。将重组载体pGexp22 转化大肠杆菌BL21 菌株,诱导表达,SDS-PAGE 分 析表明,经IPTG 诱导,p22 基因在大肠杆菌BL21 中得到了高效表达。以表达的蛋白作为抗原,免疫家 兔,制备了CCYV P22 的特异性抗血清。ACP-ELISA 检测结果表明,血清效价高达1.28 × 10⁵。Western blot 检测甜瓜叶片,结果表明抗血清能够特异性地检测CCYV 侵染的甜瓜叶片中的CCYV P22 蛋白。     

A蛋白酶联法检测苹果褪绿叶斑病毒和茎沟病毒的研究

<正> 苹果褪绿叶斑病毒(CLSV)和茎沟病毒(SGV)是苹果的两种主要潜隐病毒,严重影响苹果的产量和质量。检测苹果潜隐病毒的传统方法是木本指示植物二重芽接鉴定法,但这种方法耗工费时。由于两种病毒不稳定和在苹果树中含量低,用经典的血清学方法不能直接检测苹果植株粗汁液中的病毒。近几年国外采用酶联免疫吸附法(EL     

用离体微嫁接法快速检测苹果潜隐病毒

用离体微嫁接法同时检测了苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒和苹果茎痘病毒。由于苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒，症状是在叶部表现黄斑，试管内不易观察，病毒检出率较低，检测带毒率分别为37.5%和61.1%，在检测苹果茎痘病毒上取得成功，检出率达81.3%以上。用木本指示植物跟踪检测了带毒品种，试验证明采用离体微嫁接法检测果树病毒比用木本指示植物检测所需时间短，病毒检出率基本一致。     

3种苹果潜隐病毒多重RT-PCR检测体系的建立

 研究建立了能同时检测苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV) 、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) 和苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 的多重RT-PCR方法。以复合感染3种病毒的苹果‘望山红’组培苗为试材, 对影响多重PCR的反应条件进行了一系列的调整和优化。多重RT-PCR体系灵敏性测验显示, 最低能从RNA总量187.5 ng的样品中检测3种病毒的存在。多重RT-PCR产物的序列与报道的病毒序列有较高的同源性, 12个田间苹果样品的多重RT-PCR检测结果与单一PCR的结果一致, 初步证明了多重RT-PCR检测的准确性。     

苹果病毒的研究现状

苹果病毒病在世界各地分布广泛,目前已报道的苹果病毒有39种,中国已鉴定明确的苹果病毒有17种。根据病毒危害特点,通常把苹果病毒分为潜隐性病毒和非潜隐性病毒,其中潜隐性病毒主要有苹果褪绿叶斑病毒(A C LSV)、苹果茎痘病毒(A SPV)、苹果茎沟病毒(A SG V),非潜隐性病毒主要有苹果锈果病毒(A SSV)、苹果花叶病毒(A PM V)。苹果病毒侵染果树,主要表现为叶片失绿、畸形、生长量减少、产量下降、品质变劣等现象,严重时树体死亡。1苹果主要病毒的特性1.1苹果褪绿叶斑病毒(A pple chlorotic leaf spotTrichovirus)曾被归为长线形病毒…     

通辽市塞外红苹果中3种苹果潜隐病毒的检测及变异分析

【目的】明确通辽地区塞外红苹果（Malus pumila ‘Saiwaihong’）中苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果茎痘病毒（ASPV）和苹果茎沟病毒（ASGV）3种苹果潜隐病毒的普遍率和遗传多样性。【方法】从通辽市开鲁县8个乡镇随机采集了96份塞外红苹果枝条,采用RT-PCR法对样品进行3种苹果潜隐病毒检测。对检测为阳性的样品进行病毒基因克隆、测序,并进行序列一致性分析和系统发育分析。【结果】检测结果表明,被检测的塞外红苹果中3种苹果潜隐病毒均有不同程度的发生,并且存在2种或3种病毒的复合侵染。基于CP基因对病毒一致性和变异情况进行分析,结果表明,来源于塞外红苹果的29个ACLSV分离物的核苷酸序列一致性为78.1%～99.9%,与其他15个已知的ACLSV分离物的一致性为69.1%～93.6%;来源于塞外红苹果的12个ASPV分离物的核苷酸序列一致性为83.6%～99.7%,与其他15个已知的ASPV分离物的一致性为75.4%～91.5%;来源于塞外红苹果的21个ASGV分离物的核苷酸序列一致性为96.4%～100.0%,与其他已知的40个ASGV分离物的一致性为89.9%～...     

两步多重RT-PCR快速检测苹果潜隐性病毒

【目的】为建立检测3种苹果潜隐性病毒更为快速准确的方法,【方法】以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的成龄苹果树韧皮部为试材,根据基因库中苹果茎痘病毒(Apple stempitting virus,ASPV)的外壳蛋白基因序列,设计合成了2对特异性引物,分别与合成的苹果茎沟病毒(ASGV)引物和苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的引物组合配伍,筛选出最佳的引物对组合。对cDNA的合成所用引物和总RNA模板进行遴选和量化,对PCR过程中cDNA的用量、引物对的终浓度、退火温度等主要影响因素进行优化。【结果】结果表明,反转录引物为Oligo(dT)18、总RNA 0.1～3.0μL时,可以得到较好的cDNA;ASPV-FR与ASGV-Pch、ACLSV-Pch引物组合优于ASPV-Pch,并且筛选出4组最佳的终浓度处理组合;cDNA用量为2.0~4.0μL、退火温度为50.0~52.9℃、循环数为35时,扩增效果较好。采用优化的多重RT-PCR体系对采自陕西和山东两省的样品进行检测,并用3种病毒的单重RT-PCR体系进行验证。【结论】结果呈现高度一致性,充分印证了该多重RT-PCR体系的准确性,适用于大量样品的快速检测。