甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库构建及评价

为了探索甘蓝胞质雄性不育的分子机制并研究花药发育相关重要基因编码蛋白质间的相互作用,采用SMART技术与同源重组方法,在酵母菌株Y187中构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。以甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)Ogura细胞质雄性可育保持系‘463’为试验材料,混合其不同生长时期的花蕾,提取总RNA,利用SMART技术合成双链cDNA,产物经CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化后,与线性载体质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母菌Y187中,二者利用酵母细胞内较高的同源重组酶活性,在酵母体内进行同源重组产生有复制活性的环形文库质粒,然后在缺亮氨酸(LEU)培养基板上筛选出所有克隆,成功构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。经检测,cDNA文库的转化率为1.20×108转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.85×109 pfu/mL,重组率大于95%。该文库容量为4.5×106cfu,理论上包含了甘蓝花蕾发育相关的所有基因。     

干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库构建和鉴定

干旱胁迫作为番茄栽培生产过程中的不利因素之一,严重影响番茄生长发育、产量及品质。为完善"Micro-Tom"番茄在干旱胁迫下蛋白质互作机制,试验以"Micro-Tom"番茄品种为试验材料,采用Gateway技术构建干旱胁迫下"Micro-Tom"番茄酵母双杂交cDNA文库。酵母cDNA文库的文库滴度为6.0×10~7CFU·mL~(-1),插入cDNA片段平均长度1 kb,重组率为100%。结果表明,试验构建的干旱胁迫下"Micro-Tom"番茄酵母双杂交cDNA文库质量较高,完整度较好,可作为筛选互作蛋白的cDNA文库。     

利用番茄cDNA酵母双杂交文库筛选Pti4互作蛋白

以番茄的根、叶、花及不同发育时期的果实提取RNA,构建酵母双杂交文库。经检测,文库容量为1.1×10~7 CFU,阳性率大于95%,插入片段平均长度大于1 000 bp,可用于互作蛋白的筛选。依据番茄抗病途径相关基因Pti4编码序列设计引物,构建重组诱饵载体并转化酵母菌,筛选与Pti4相互作用的蛋白质。经初步检测获得6个可能与Pti4互作的转录因子,为进一步研究番茄Pti基因的作用机制提供了基础。     

霜霉菌侵染后葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库构建

[目的]构建霜霉菌侵染后葡萄叶片的酵母双杂交cDNA文库,筛选致病因子在寄主葡萄体内的互作靶标,为葡萄霜霉病菌致病的分子机理研究提供材料基础.[方法]以一年生欧亚种葡萄西拉盆栽苗为试验材料,提取并等量混合霜霉菌侵染后0、12、18、24和36 h的葡萄叶片总RNA,利用基于Gateway技术的CloneMiner II cDNA文库构建试剂盒:首先将cDNA与pDONR222载体进行BP重组反应连接,连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞构建初级文库;然后初级文库质粒与pGADT7-DEST载体通过LR重组反应,重组反应产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞构建次级文库;再随机挑取次级文库转化Y187酵母菌株构建酵母双杂交cDNA文库;最后利用ImageJ软件和PCR反应分别统计库容量和鉴定重组率.[结果]构建的初级文库库容量为4.6×107 CFU,次级文库库容量为2.7×107 CFU,均达到构建cDNA文库的标准.酵母双杂交cDNA文库的插入片段主要集中在1000~2000 bp,且具有很好的多态性,文库质量较高.[结论]构建的霜霉菌诱导葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库符合酵母双杂交筛选要求,可用于筛选霜霉菌致病效应蛋白在寄主体内的靶标及霜霉菌侵染寄主葡萄早期抑制寄主免疫过程中的致病机理研究.     

PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建及鉴定

[目的]构建PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库,为深入研究猪伪狂犬病病毒(PRV)与宿主细胞间的相互作用机制打下基础.[方法]提取PK-15细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA(ds cDNA),并对其进行均一化和SfiI酶切处理.处理后的ds cDNA分别连接3种阅读框pGADT7-SfiI载体,将连接产物转化至大肠杆菌BH5α构建三框cDNA初级文库,取三框cDNA初级文库进行混合扩增,通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集文库细菌提取文库质粒.[结果]3种读码框cDNA文库的库容量分别为3.0× 106、2.0× 106和2.0× 106 CFU,文库实际扩增基数>150万CFU;一号和三号读码框的基因重组率均为100%,二号读码框的基因重组率大于93%.cDNA文库外源基因插入片段长度在500~3000 bp.cDNA文库质粒浓度约1.0 mg/mL,质粒收获量约3.0 mg.[结论]构建的PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库具有较高的重组率和库容量,符合酵母双杂交筛选要求,可用于研究PRV与PK-15细胞间的相互作用机制.     

小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定

以中国春小麦叶、茎、幼穗及花后3、6、9、12、15、20、25 d的籽粒为材料,利用Gateway技术构建中国春小麦cDNA初级文库和次级文库,由次级文库质粒转化Y187酵母菌株构建出酵母双杂交文库。通过mating法筛选小麦粒质量基因TaDAR1的互作蛋白,以此来鉴定文库的有效性。结果表明：初级文库容量为1.82×10⁷ CFU/mL、次级文库的容量为1.91×10⁷ CFU/mL,文库重组率均大于 96%,插入片段平均长度在 1 000 bp 以上。酵母双杂交文库转化效率为1.97×10 CFU/μg,文库容量为2.04×10⁷ CFU/mL。构建诱饵载体pGBKT7-TaDAR1并转化Y2H酵母菌株,经检验存在自激活现象,进一步截断检测发现此蛋白N端无自激活,C端有自激活,以BD-TaDAR1-N为诱饵载体,筛选酵母文库,获得其互作蛋白序列,并命名为TaDAR1IP,经回转验证TaDAR1-N与TaDAR1IP存在相互作用关系。表明本试验方案构建的酵母文库是高质量的有效的。为初学者构建酵母双杂文库及使用“mating”法筛选酵母文库提供借鉴,也为后续小麦基因功能的研究奠定基础。     

芍药种子休眠解除过程的酵母杂交cDNA文库构建

【目的】芍药具有极佳的观赏价值,但其种子的双重休眠难以解除,严重阻碍芍药的育种进程。本研究利用gateway技术构建芍药种子休眠解除关键时期的酵母杂交cDNA文库,可用于筛选调控芍药种子休眠解除相关基因的转录因子及互作蛋白。本文库的构建可为丰富芍药种子休眠调控研究提供科学支撑,能为芍药栽培育种和野生资源保护及利用奠定分子理论基础。【方法】本研究以休眠解除过程中5个关键时期的芍药种子为试验材料,进行总RNA的提取和m RNA的分离,使用gateway方法构建cDNA初级文库,再通过LR重组,将初级文库重组到pGADT7-DEST次级文库载体上,构建出次级文库,最后经过酵母转化试验,将次级文库质粒转化到酵母Y187感受态细胞中,构建出芍药种子休眠解除过程的酵母文库。【结果】经鉴定,cDNA初级文库库容量为1.28×107 CFU,平均插入片段长度在1 000 bp以上,重组率为100%;cDNA次级文库库容量为1.12×107 CFU,平均插入片段长度在1 000 bp以上,重组率为100%;酵母文库滴度为7.0×107 CFU/mL,平均插入片段长度在1 000 bp以上,重组率为96%...     

稻曲病菌侵染水稻颖花的酵母双杂交cDNA文库构建与应用

【目的】近年来稻曲病日益严重,但目前对稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)与水稻相互作用机制仍不清楚。论文旨在利用水稻感病颖花材料构建酵母双杂交文库并筛选稻曲病菌效应因子互作蛋白,为解析稻曲病菌侵染水稻机制提供理论基础。【方法】以感病水稻Chuannong H2S为试验材料,在水稻破口前5—7 d左右,从水稻穗中上部接种PSB摇培7 d的稻曲病菌荧光标记菌株P4,接种13 d后取颖花进行激光共聚焦观察,收集感病颖花。提取感病颖花总RNA,使用含有Oligo(dT)的接头引物反转录cDNA第一链,并PCR扩增ds cDNA,通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收ds cDNA片段,与载体p GADT7-Rec进行同源重组,转化酵母菌株Y187构建酵母双杂交cDNA文库。然后用稻曲病菌效应因子Uv_1261基因构建诱饵载体,将诱饵载体转化入Y2HGold酵母菌株,通过酵母双杂交自激活验证后以该诱饵载体筛选酵母双杂交文库,最终在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上筛选出生长状况良好的蓝色单菌落,经测序得到候选互作蛋白的序列,通过NCBI在线网站进行Blast分析和Uniprot在线网站进行gene ontology(GO)注释。【结果】经检测,文库滴度为5.7×108 cfu/mL,平均插入片段大小为750 bp,表明稻曲病菌侵染水稻颖花cDNA文库质量较高。用Uv_1261构建诱饵载体,转化Y2HGold后,转化菌可在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长,不能在SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A平板上生长,表明Uv_1261无自激活现象。以该诱饵载体筛选文库,对筛选到的候选互作蛋白进行测序验证并Blast分析获得了56个来自稻曲病菌或水稻的候选互作蛋白,其中有28个候选互作蛋白来自稻曲病菌,有16个来自水稻,以及12个未知蛋白。经GO注释显示,来自稻曲病菌中的候选互作蛋白参与了17个生物过程,包括翻译、代谢过程、氧化还原及胞内氨基酸合成等;分子功能包括金属离子结合活性、水解酶活性及ATP结合活性等;细胞组分包括核糖体、细胞质及线粒体等。来自水稻中的候选互作蛋白参与了11个生物过程,包括蛋白质去磷酸化、糖代谢及翻译等;分子功能包括金属离子结合活性、核苷酸结合活性及转移酶活性等;细胞组分包括核糖体、膜及细胞核等。【结论】该cDNA文库质量较好,能成功地用于稻曲病菌效应蛋白的互作蛋白筛选,可为研究稻曲病菌与水稻相互作用的分子机制提供重要资源。     

白背飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建

白背飞虱(Sogatella furcifera Horváth)作为一种迁飞性害虫,不仅自身危害水稻,而且以持久性方式传播南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)。为了研究白背飞虱与SRBSDV之间的相互作用,需要构建一个高质量的酵母筛选文库,试验利用Gateway技术构建了白背飞虱cDNA酵母表达文库,检测分析显示,白背飞虱初级文库库容量约为1.72×10~7CFU,cDNA插入片段主要分布在500~2 000 bp,重组率约为95.8%;次级文库库容量约为1.73×10~7CFU,cDNA插入片段主要分布在400~2 000bp,重组率为100%;Y187酵母菌株的白背飞虱酵母双杂交cDNA文库库容量约5.09×10~7CFU,插入片段大小在750~2 000 bp,重组率100%,再随机挑选36个单克隆进行测序分析,所得结果与Gen Bank数据库比对显示36个克隆中含有22个不同的基因,长度在750~2 000 bp,这些分析表明,该文库可以用于酵母双杂交的后续筛选,为研究白背飞虱与SRBSDV之间的互作奠定了基础。     

喉癌细胞酵母双杂交cDNA文库的构建

目的构建喉癌(Hep-2)细胞的酵母双杂交cDNA文库,为筛选包涵体膜蛋白分子的作用配体提供前期工作基础.方法从Hep-2细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的Hep-2细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库.结果所构建的文库展现出良好的多态性.结论可用于酵母双杂交系统的筛选.     

Cf-19介导的抗番茄叶霉病（Cladosporium fulvum）免疫应答酵母双杂交cDNA文库构建和鉴定

番茄叶霉病(Cladosporium fulvum)是番茄栽培生产中最严重的病害之一,造成严重经济损失。Cf-19基因是目前已知抗性最强、抗性范围最广的叶霉病抗病基因之一,其免疫应答过程具有代表性,为研究Cf-19介导的免疫应答过程中蛋白质互作机制,采用Gateway技术构建Cf-19介导的抗番茄叶霉病免疫应答酵母双杂交cDNA文库。结果表明,酵母cDNA文库滴度为5.0×10~7CFU·mL~(-1),重组率为100%,cDNA文库插入片段长度500～2 000 bp,插入片段平均长度1 000 bp以上。由此可知,Cf-19介导的抗番茄叶霉病(C. fulvum)免疫应答酵母双杂交cDNA文库,可用于筛选互作蛋白。     

猪脂肪组织酵母双杂交文库的构建及质量鉴定

为了研究猪脂肪细胞分化的蛋白质之间的相互作用,采用LR重组反应的方法,构建猪脂肪组织酵母双杂交文库。结果显示,酵母双杂交文库的库容量为5.28×106CFU。随机挑取的24个克隆均带有插入片段,重组率100%,片段大小多数为1~2 kb,表明构建的文库质量较高。     

盐胁迫下大麦酵母双杂交文库的构建与鉴定

为研究盐胁迫下大麦耐盐相关蛋白的互作蛋白,利用Gateway技术构建盐胁迫下大麦的酵母双杂交文库。首先提取受盐胁迫的大麦总RNA,分离mRNA并合成双链cDNA,并通过位点特异重组系统(BP重组)将双链cDNA转入pDONR22载体,构建初级文库。然后,将初级文库质粒通过同源重组转入pGADT7-DEST载体,构建次级文库。最后,将次级文库质粒转入酵母菌株Y187中构建酵母双杂交文库。经鉴定,该酵母双杂交文库的滴度为7.0×10~7 CFU/mL,插入cDNA片段平均长度大于1 000 bp,重组率大于95.8%。所构建的酵母双杂交文库质量较高,可用于后续的互作蛋白筛选工作。     

花生干旱及高盐胁迫下的酵母双杂交文库构建

干旱、高盐等胁迫对花生的产量和品质影响较大,为了挖掘花生耐干旱和高盐胁迫相关基因,并阐释其编码蛋白质间的互作关系,本研究利用SMART技术,构建了花生干旱及高盐胁迫下的酵母双杂交文库。结果表明,构建的文库容量为1.26×106CFU,文库滴度达到1.07×108CFU/ml,从随机挑选的16个克隆的PCR结果来看,插入片段大小差异明显,主要分布在500~2 000 bp,重组率为100%。说明该文库具有较高的质量,可以用于进一步的筛选工作。     

低温胁迫下山葡萄叶片酵母cDNA文库构建

【目的】葡萄栽培过程中,由低温造成的冷害或冻害严重影响葡萄的生长发育、果实品质和产量。山葡萄是葡萄抗寒育种的重要种质资源,本文通过构建低温胁迫下山葡萄叶片酵母cDNA文库,为葡萄抗寒分子机理研究提供物质基础。【方法】以抗寒山葡萄左山-1(V. amuerensis cv.Zuoshan-1)扦插盆栽苗为材料,提取4℃低温处理0、2、4、8、12、24 h后叶片总RNA,采用SMART技术反转录为cDNA,经纯化和短片段去除后克隆至pGADT7三框质粒载体上,经过纯化后获得初级cDNA文库,对初级文库进行扩增、提取文库质粒后转入酵母Y187菌株中,制作扩增的酵母文库,并对文库质量进行鉴定。【结果】经检测所构建的3个读码框初级文库库容分别为1.7×10⁶、2.0×10⁶和1.9×10⁶ cfu,重组率为100%,插入的片段长度主要分布在500～2 000 bp;电泳检测和测序结果表明,插入片段所对应的编码蛋白类型丰富,具有良好的多态性。最终获得的Y187酵母文库滴度为4.0×10⁸ cfu·mL     

巴西橡胶树胶乳酵母双杂交cDNA表达文库的构建及分析

提取巴西橡胶树胶乳总RNA,并纯化mRNA.采用特异引物（oligo-dT）反转出第一链DNA,经LDPCR合成第二链DNA.将ds cDNA和经Sma Ⅰ线性化的pGADT7-Rec质粒共转化Y187酵母菌,构建酵母双杂交cDNA表达文库.结果表明,转化单菌落个数为2.8 ×107;文库滴度为4.92×107·mL-1;插入片段大小主要分布于500 ～2 000 bp间;重组率为96％.实验数据表明该文库能满足后续的杂交筛选.     

水稻幼苗酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为解析水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)与寄主水稻的互作机制,筛选水稻中与病毒互作的蛋白,以易感RBSDV的水稻品种日本晴3~4叶期的组织样品为材料,通过提取总RNA后分离获得m RNA,合成cDNA双链后连入pDONR222载体,获得初级文库。初级文库的滴度为6.6×10~6CFU/mL,库容为1.9×10~7CFU,重组率95%,插入片段平均长度1 kb。提取初级文库质粒,通过重组反应将水稻cDNA文库转移至pGADT7-DEST载体,构建获得水稻幼苗的酵母双杂交cDNA文库,文库的滴度为4.5×10~6CFU/mL,库容为1.3×10~7CFU,重组率95%,cDNA插入片段平均长度1 kb。采用RBSDV候选基因进行文库筛选,结果表明所构建的酵母文库可用于筛选病毒互作蛋白。     

玉米叶片酵母双杂交cDNA文库的构建及评价

以玉米骨干自交系478为试验材料,从各生长时期的叶片中提取总RNA后,再利用磁珠法从中分离纯化出mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA)。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母菌株AH109中构建了玉米叶片全长cDNA文库。经检测,文库的转化率为1.54×107转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.03×106pfu/mL,重组率为95%。