苍白杆菌SY286抑菌活性蛋白稳定性分析

利用饱和硫酸铵沉淀法从苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)SY286发酵滤液中提取抑菌活性蛋白,通过温度、酸碱度、紫外线以及蛋白酶对活性物质的影响,测定活性物质的稳定性.结果表明,经60％饱和硫酸铵溶液盐析出的活性蛋白对葡萄霜霉病菌的抑菌活性最强,抑制率达81.98％.温度、酸碱度以及紫外线对抑菌粗提蛋白的活性...     

来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶基因的克隆

有机磷化合物作为一类高效广谱的杀虫剂被广泛使用,在使用的同时也造成了大面积的环境污染。本研究从被农药高度污染的土壤中筛选到了一株对甲基对硫磷农药有高效降解能力的细菌,通过16S rDNA鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)。克隆该菌的有机磷降解酶编码基因mphxw,构建原核表达载体,其表达产物具有正常生物学活性,同时纯化了重组酶。     

蜡样芽胞杆菌纤维素酶基因的克隆与其在乳酸菌中的表达

全球每年可产生的纤维素数量庞大。为了探索纤维素资源,更为科学合理的利用纤维素类饲料提供理论依据,根据蜡样芽胞杆菌纤维素酶基因序列设计1对特异性引物,扩增纤维素酶(Cell)基因,获得片段大小约为1 269bp的目的基因。该基因与Bacillus cereus B4264、Bacillus cereus G9842纤维素酶基因序列同源性分别达96%和95%。将Cell基因与乳酸乳球菌表达载体pNZ8149进行连接,电转化入乳酸菌NZ3900中,构建纤维素高效分解基因工程乳酸菌,经乳链菌肽(Nisin)诱导表达,SDS-PAGE分析得到分子量大小约为42kDa的目的片段。刚果红平板验证该表达蛋白具有纤维分解活性。FPA法测定表达产物酶活力为0.57U/mL。该基因的成功表达,对纤维素基因工程菌的相关研究具有指导意义。     

纤维素酶高产菌的筛选鉴定及纤维素酶基因的克隆与表达

为寻找新纤维素酶和纤维素酶基因资源,以羧甲基纤维素钠(CMC)改良的BHM培养基筛选菌株,经初筛和复筛筛选出目的菌株后,采用革兰氏染色法和16SrDNA基因片段比对法对筛选出的菌株进行鉴定;设计引物对P扩增其纤维素酶基因,连于pET-28a(+)载体构建原核表达载体并转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,表达结果采用SDS-PAGE和测定表达产物活性的方法来检验。结果显示,本研究成功筛选出一株新的具有较高纤维素酶活的短小芽孢杆菌BY-1,该菌所产纤维素酶具有较好的热稳定性和酸碱稳定性,最适宜温度和pH分别为55℃和7.45,在此条件下最高酶活性为0.921 6μmol/(mL.min);此外,还成功克隆出1个1 851bp的纤维素酶新基因bglC-BY,具有GH9/CBM3纤维素酶结构,经IPTG诱导,SDS-PAGE图谱上于70ku有1个明显的蛋白条带,表达产物酶活性为0.541 3μmol/(mL.min)。本研究筛选出的短小芽孢杆菌内切纤维素酶活较高,具有一定的应用前景。     

产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从产酶溶杆菌OH11菌株中克隆到编码几丁质酶的chiA基因.同源性比较发现,其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的ChiA有97%以上的序列一致性.基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a( )上构建重组质粒pChiA,并转化宿主菌BL21(AI)产生BLChiA表达菌株.经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后发现,BLChiA菌株产生相对分子质量约为75×103的蛋白质.生物活性试验表明,该蛋白能水解几丁质,在几丁质培养基上产生一透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用.因此该蛋白具有一定的生物防治作用.     

绿色木霉纤维素酶CBHI基因的克隆与原核表达

绿色木霉(Trichoderma viride)所产生纤维素酶可将秸秆天然纤维素组分转化为可发酵的糖,不仅对废物进行再利用,还可以减少环境污染.以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106总RNA为模板,利用RT-PCR技术反转录合成外切葡聚糖水解酶(CBHI)基因约1545bp的cDNA片段.该序列与GenBank中的cbhI E00389序列比较,氨基酸序列同源性达91％.大肠杆菌BL21原核表达和SDS-PAGE结果表明,重组蛋白分子量约为53kDa,重组酶活力为5.3U· mg-1.     

苏云金芽孢杆菌BJH705菌株cry7Ab基因的克隆及表达

从海南地区土壤中分离得到1株苏云金芽孢杆菌(Bt)BJH705。经PCR鉴定结果显示,该菌中含有cry7Ab类基因,其晶体形态为双锥形;以全长引物对其进行扩增,得到大小为3 417 bp的片段;通过SDS-PAGE结果显示,此菌株Cry7Ab杀虫晶体蛋白分子量约为130 ku,编码1 139个氨基酸残基,等电点为4.83;序列已提交Gen Bank注册,登录号为KX010669;对Cry7Ab蛋白的跨膜区域进行分析,得到此蛋白由亲水域和疏水域形成跨膜区,其跨膜区大约由19个疏水氨基酸组成,经Cry7Ab蛋白保守结构域分析含有3个结构域。     

生防菌株SY286对葡萄霜霉病菌的抑菌效果

研究了生防细菌SY286菌株对葡萄霜霉病菌的抑菌效果,试验结果表明:SY286菌株在代谢过程中能够产生纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素等抑菌代谢产物;SY286的发酵液成分可导致葡萄霜霉病菌菌丝及孢子囊出现皱缩、破裂等现象;SY286振荡培养3d,抑菌效果最大,达93.18%;60%的硫酸铵饱和度下提取的抑菌粗提蛋白对葡萄霜霉病菌的抑菌效果最好,抑菌效果可达76.30%。     

肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达

[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达。[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a（＋）上构建表达载体,重组质粒转化E.coil BL21（DE3）进行蛋白质表达。[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a（＋）载体上,重组质粒转入E.coil BL21（DE3）后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白。[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础。     

纤维素酶系基因的克隆与序列分析

根据Gen Bank已报道的枯草芽孢杆菌的基因序列,设计特异性引物,经PCR分别从B.subtilis L、B.subtilis K基因组中扩增得到3个纤维素酶基因序列,基因片段分别长约700、1 500、1 700 bp。连接到T载体上进行测序,获得该3个纤维素酶基因片段的DNA序列,在线比对分析表明3个基因的部分碱基序列与已报道的纤维素酶基因的序列同源性达99%。这3个基因的全序列在Gen Bank中未见报道,且通过软件对比,三者没有任何相似性。根据3个纤维素酶基因的来源分别命名为Lcen、Ken、Kkg。借助软件分析确定Lcen基因全长699 bp,基因序列为1个完整的阅读框,连续编码232个氨基酸。Ken基因全长1 500 bp,连续编码499个氨基酸。Kkg基因全长1 686 bp,基因序列为1个完整的阅读框,连续编码561个氨基酸。3个基因均属于纤维素酶家族大类。     

产Zwittermicin A的苏云金芽孢杆菌菌株的筛选及抗性基因zmaR的克隆与表达

 通过PCR方法筛选160株苏云金芽孢杆菌，其中94株含有zmaR基因。测定了含zmaR基因的菌株培养物上清液对草生欧文氏杆菌（Erwinia herbicola）的抑菌活性，结果表明有67株菌有抑菌活性，其中21株抑菌活性较高。经鉴定，抑菌活性较高的G03菌株含有cry1Ac、cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab等高毒力杀虫基因，并从G03中克隆了zmaR全长基因，完成了序列测定。该基因编码区为1 125 bp，由核苷酸序列推导的氨基酸残基组成为375个，分子量为43.5 kD，等电点pI4.945。通过载体pET-21b将zmaR基因导入大肠杆菌BL21，可正常表达43.5 kD蛋白，并使宿主菌产生对Zwittermicin A的抗性。     

枯草芽孢杆菌apr基因的克隆和表达

通过PCR技术克隆枯草芽孢杆菌蛋白酶apr基因,并分别对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果表明,apr基因序列全长1509bp,编码503个氨基酸,同源性100%;克隆到表达质粒pET-22b(+)后,将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,蛋白分子质量为55ku。测定酶活为19500U·mL-1。该基因克隆和表达的成功对于制备大豆抗氧化肽具有实际应用价值,对进一步深入研究其生物学和酶学机制具有重要意义。     

福寿螺多功能纤维素酶基因egx的克隆及其体外功能性表达

 【目的】克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx,并在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行表达分析。【方法】通过RT-PCR的方法,从福寿螺胃组织总RNA中克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx序列,连接克隆载体pMD18-T,再通过Eco RⅠ和NotⅠ两个酶切位点分别与表达载体pET-32a（+）及pcDNA3.1（+）连接,构建原核、真核表达载体,并在E.coli BL-21（DE3）和猪肾细胞PK15中进行表达,最后采用DNS法测定表达产物酶学活性。【结果】RT-PCR扩增得到1 326 bp的序列,包括1 185 bp的编码序列和部分侧翼序列,编码序列与已报道的福寿螺多功能纤维素酶基因cDNA序列相似性为99%,氨基酸序列相似性为100%。原核细胞表达产物经包涵体复性后,对羧甲基纤维素钠、2-羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、微晶纤维素、木聚糖的水解活性分别为：24.78、15.67、18.42、600.91和175.43 U•mg-1;而在PK15细胞中重组酶对以上5种底物的活性分别为：0.84、0.78、1.01、14.62和4.23 U•mL-1。【结论】克隆出了福寿螺多功能纤维素酶基因,并能在大肠杆菌和哺乳动物细胞中成功地表达。     

产酶溶杆菌OH11菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从OH11菌株中克隆到β-1,3-葡聚糖酶基因,通过同源性比较发现其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的β-1,3-葡聚糖酶有90%以上的同源性。该基因经NdeⅠ、XhoⅡ或HindⅢ酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a( )和载体pET30a( )上构建重组质粒,并分别转化宿主菌BL21(AI)和BL21(DE3)产生表达菌株。表达菌株BLGluA和BLGluC经IPTG诱导后分别产生相对分子量约为29 000(GluA蛋白)和44 000(GluC蛋白)的蛋白。酶活性和抑菌活性测定结果表明,GluA蛋白和GluC蛋白能将海带多糖水解,在海带多糖培养基上产生透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用,具有一定的生物防治作用。     

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆与表达

产淀粉酶高温菌在淀粉酶的生产中具有重要意义。从温泉中分离到1株可在60℃快速生长的淀粉酶产生菌A12，经16SrDNA序列比较和丙酸盐利用等实验将其鉴定为地衣芽孢杆菌。构建了地衣芽孢杆菌A12基因库，并从中克隆到一个α-淀粉酶基因amyA1，对其进行了测序分析，并在大肠杆菌中实现了表达。本研究为构建一个耐高温淀粉酶生产用工程菌奠定了基础。     

根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解代谢中agnH基因的克隆表达与纯化

对从湖北省襄阳市烟草种植土壤中分离筛选得到的尼古丁降解菌根癌土壤杆菌SCUEC1菌株中agnH基因进行克隆表达,并对AgnH蛋白的表达和纯化条件进行优化,为解析agnH基因的功能和揭示根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解的分子机制提供理论依据。通过PCR扩增获得agnH全长基因(585bp),构建重组质粒pET28a(+)-agnH,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,研究不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对重组质粒pET28a(+)-agnH诱导表达的影响,用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱重组蛋白,采用SDS-PAGE检测重组蛋白。结果表明:在IPTG浓度为0.4mmol/L、诱导温度为25℃且诱导时间为25h条件下,AgnH蛋白表达量较高;在250mmol/L的咪唑洗脱液洗脱下,得到浓度较高的AgnH蛋白。     

苏云金芽孢杆菌LLP29菌株中ykkB基因的克隆、表达及活性分析

乙酰化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式,可参与多种细胞进程,但迄今未见有关乙酰化修饰在Bt中发挥作用的报道.本课题组前期通过对高效杀虫Bt菌株LLP29的基因组进行测序分析,发现该菌株也存在编码乙酰转移酶的基因(如ykkB).为探讨乙酰化修饰在Bt菌株中的作用,以ykkB为靶标,利用无缝克隆技术成功克隆与测序了ykkB基因.通过生物信息学分析,发现该基因编码的蛋白可能是一类N-乙酰转移酶,赖氨酸和亮氨酸含量最高,半胱氨酸含量最低,是一种亲水性蛋白质,且无跨膜区;同时,成功表达、纯化了YkkB蛋白,通过体外自乙酰化分析,证实该蛋白可发挥乙酰基转移的作用.     

苏云金杆菌8010cryIA基因的克隆和表达

苏云金杆菌８０１０ｃｒｙＩＡ基因的克隆和表达ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｒｙＩＡＧｅｎｅｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ８０１０苏云金杆菌是目前世界上产量最大的微生物杀虫剂。应用生物工程技术进行遗传操纵，可以提高野生型...     

解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达

为了获得高效的中性蛋白酶基因,试验用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌中扩增中性蛋白酶基因(npr),通过Bam HⅠ、SalⅠ双酶切后,将该基因与表达载体PET-28a连接,同时转入到大肠杆菌BL21中表达,通过SDS-PAGE电泳技术对构建的工程菌的基因表达产物进行分析。获得特异npr基因序列含1 566 bp,编码522个氨基酸,含有完整的ORF,同源性达到100%。蛋白酶的分子量为57.4 k Da。IPTG能诱导中性蛋白酶基因在重组菌进行表达,通过改变IPTG诱导浓度、诱导温度及诱导时间等因素,得出在添加剂IPTG至终浓度为0.8 mmol·L-1,30℃诱导4 h为最佳诱导条件,获得最高酶活为450 U·m L-1。     

菌株尼古丁降解代谢中agnH基因的克隆表达与纯化

对从湖北省襄阳市烟草种植土壤中分离筛选得到的尼古丁降解菌根癌土壤杆菌SCUEC1菌株中agnH基因进行克隆表达,并对AgnH蛋白的表达和纯化条件进行优化,为解析agnH基因的功能和揭示根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解的分子机制提供理论依据。通过PCR扩增获得agnH全长基因(585 bp),构建重组质粒pET28a(+)agnH,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,研究不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对重组质粒pET28a(+)agnH诱导表达的影响,用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱重组蛋白,采用SDS-PAGE检测重组蛋白。结果表明：在IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导温度为25℃且诱导时间为25 h条件下,AgnH蛋白表达量较高;在250 mmol/L的咪唑洗脱液洗脱下,得到浓度较高的AgnH蛋白。