CRISPR/Cas9技术在天目地黄RcPDS1基因编辑中的应用

为了研究CRISPR/Cas9技术在天目地黄基因编辑中的应用,克隆了天目地黄（Rehmannia chingii）的八氢番茄红素脱氢酶基因（Rc PDS1）,利用PCR方法扩增其c DNA序列和基因组DNA序列。通过构建单靶点CRISPR/Cas9载体,利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法侵染天目地黄无菌苗叶盘,通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。结果显示,克隆获得了1个天目地黄Rc PDS1的全长c DNA序列,其具有1个长度为1 743 bp的开放阅读框,编码580个氨基酸残基,基因组DNA序列长度8 041 bp,包含14个内含子和15个外显子。通过遗传转化共获得57个转基因再生株系,其中具明显白化表型的株系有20个（35.09%）。TA克隆测序结果显示,Rc PDS1靶位点突变类型主要包括碱基缺失、替换和插入。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在天目地黄中成功实现了对Rc PDS1基因的靶向敲除。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状

大型真菌与人类生活密切相关,但大部分大型真菌缺乏高效的遗传操作系统,极大地影响了功能基因功能分析及遗传改良研究。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅速,已经成为生命科学研究领域不可或缺的技术之一。笔者概述了CRISPR/Cas系统的结构类型及CRISPR/Cas9系统作用机理,介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状,并针对Cas9和sgRNA的表达、遗传转化策略、靶位点选择等影响编辑效率的关键问题进行了分析讨论,旨在为该技术在大型真菌研究中的应用提供参考。     

应用CRISPR/Cas9体系对番茄PSY 1基因的定点编辑

基于NCBI数据库提供的番茄八氢番茄红素合成酶基因(PSY 1)全长,并根据基因序列中PAM(proto adjacent motif)的位置设计特异性sg RNA,构建CRISPR/Cas9 Level 1、Level 2载体;将设计好的载体转化农杆菌,继而转染番茄子叶,利用PCR产物测序法检测sg RNA在番茄基因组中的敲除效率。结果表明,36个转基因植株中有22个PSY 1基因目标区出现不同数目的碱基缺失、增加或互换,初步估计基因敲除效率为61%。本试验在番茄中初步建立了CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在番茄中实现基因敲除。     

CRISPR/Cas9介导柑橘CsLOB1基因启动子的多位点编辑

为了获得CsLOB1启动子较大片段删除的突变体,利用CRISPR/Cas9技术对CsLOB1启动子进行多位点编辑。通过在CsLOB1启动子的EBEPthA4区域及其上、下游设计不同的靶标位点,构建了2个植物表达载体pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites,分别对CsLOB1启动子同时进行2个位点和3个位点的编辑。测序结果表明pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites的基因编辑效率分别为64.7%和80.0%,突变体植株在2个sgRNA之间发生了DNA片段的删除。进一步的分析发现,不同的sgRNA具有不同的突变效率,其差异是由于不同的sgRNA对CsLOB1-识别和结合能力的差异造成的。本结果表明对CsLOB1启动子进行多位点编辑可以获得删除较大DNA片段的突变体。     

利用CRISPR/Cas9敲除葡萄VviPDS1基因的研究

选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。     

农杆菌介导的Cas9基因转化金针菇的研究

将酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9序列(SpCas9序列,Addgene#43802)根据金针菇(Flammulina velutipes)的密码子偏好性进行优化,并构建FvCas9双元表达载体,利用农杆菌介导法转化金针菇单核体Dan3,经抗性培养基筛选以及潮霉素和Cas9基因PCR扩增验证,结果显示Cas9基因已经成功转入金针菇菌丝体中,转化率为6.84%。     

梨愈伤组织双靶点CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

为了在梨愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系,将proDAM3:GUS转入‘茄梨’愈伤组织,通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法侵染proD AM3:GUS转基因梨愈伤组织,通过测序及GUS染色的方法检验敲除效果,分析靶基因突变类型。结果表明,共有4个转基因株系在靶位点处发生了基因突变,编辑效率为66.7%。对所有基因编辑株系的有效克隆进行分析,结果显示sgRNA1在靶位点GUST1的突变频率达到71.4%,高于sgRNA2在靶位点GUST2突变频率的46.4%,说明sgRNA1可以更有效地与靶位点结合。测序结果表明,4个基因编辑株系中GUS基因均被敲除,基因突变的类型包含碱基缺失、插入及两个靶点之间大片段的缺失,不存在碱基替换。GUS染色结果显示,基因敲除后的GUS转基因愈伤完全呈白色,说明利用CRISPR/Cas9多靶点基因编辑系统可以在梨愈伤组织中实现高效的基因敲除。     

番茄CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术体系构建与应用

为了构建番茄CRISPR/Cas9介导的多基因编辑体系,用SlU6-2p、SlU6-3p、SlU6-7p、SlU3-5p、SlU3-9p和SlU6-5p启动子分别替换pKSE401和pCBC-DT1T2载体中的拟南芥U6启动子,构建了1个双元载体（p MGET）、2个中间载体（pKC-S2M和pKC-S3M）和3个gRNA模块载体（pCBC-S1、pCBC-S2和pCBC-S3）。为了测试该多基因编辑体系,通过PCR扩增、Goldengate克隆和同尾酶技术,将含有6个番茄果实性状相关基因Green flesh(GF)、Ovate(O)、Locule number(LC)、SlMYB12(Y)、Tangerine(T)、Uniformripening(U)靶点序列的sgRNA聚合构建多基因编辑载体pMGET-OYGTULC和pMGET-TULCOYG,检测6个基因同时被编辑的效率分别为44.00%和11.76%。用携带pMGET-OYGTULC载体的根癌农杆菌转化番茄材料获得2株6个基因均被编辑的植株,序列变异为单个碱基的插入、单个或多个碱基的缺失及大片段的缺失等多种形式。本研究中该多...     

CRISPR/Cas9系统在园林植物中的研究展望

CRISPR/Cas9系统是近年来迅速发展起来的一种新型基因编辑技术,作为一种高效的育种研究技术已在多种植物中实现了定点突变,具有广阔的应用前景。园林植物观赏性状的改良对丰富园林景观具有重要的作用,但是园林植物的遗传背景复杂,严重制约了基因编辑技术的应用。该文介绍了CRISPR/Cas9系统的基本原理及在植物中的研究进展,总结了CRISPR/Cas9系统针对不同类型植物适合的筛选方法及目前存在的问题,并展望了该技术在园林植物育种中的发展前景,以期能够高效利用CRISPR/Cas9系统改良无基因组参考的植物,快速获得观赏价值高的新品种。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在果树作物中的应用研究进展北大核心CSCD

成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)已成为一种有价值的基因组编辑工具,能够在特定选择的位点改变DNA序列,可以在作物基因组的靶点位置精确地实现删除、替换或插入特定序列,引入理想的目标性状。该工具具有简单、高效、成本低以及功能强大等特性,在柑橘、葡萄、香蕉和草莓等果树中已实现多种类型的应用,包含产生白化表型、调控童期和花期、调控果实品质以及创造矮化和抗病虫害品种等。综述了CRISPR/Cas9系统及其作用过程,介绍了新开发的精准编辑技术,包括单碱基编辑器、引导编辑及CRISPR/Cpf1多基因编辑系统,并详细阐述了CRISPR/Cas9系统在果树基因组编辑中的应用进展,包括果树种类、目标基因及目标性状等,归纳了CRISPR/Cas9系统实现高效编辑所遇到的遗传转化和再生体系、脱靶效应和启动子选择问题,最后提出了不断优化遗传转化和再生体系、合理选择靶位点和设计sgRNA、植物内源启动子及新编辑技术的解决策略。     

利用西瓜愈伤组织快速检测CRISPR/Cas9基因编辑效率

西瓜作为重要的园艺经济作物,其CRISPR/Cas9基因编辑效率的快速检测方法仍十分匮乏。以愈伤组织再生能力强的野生西瓜种质ZTC为试验材料,针对西瓜ClPDS基因构建CRISPR/Cas9双靶点敲除载体,利用农杆菌侵染西瓜幼嫩子叶,在含1.0 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸生长素的MS培养基中诱导愈伤组织形成,通过绿色荧光蛋白标记筛选阳性愈伤组织,检测其编辑效率。结果表明,2个靶点均发生基因编辑,靶点1处的编辑效率为42.95%,靶点2处的编辑效率为29.92%。在愈伤组织中建立了西瓜生长发育早期有效基因编辑效率检测体系,为后续编辑株系的确定节约了大量时间,为基因编辑技术应用于西瓜重要农艺性状改良及优异种质创制提供了技术支撑。     

茄子U6启动子克隆及CRISPR/Cas9介导的基因编辑体系建立

利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)U6RNA保守序列从茄子(Solanum melongena L.)基因组中鉴定到7个U6 RNA,并采用PCR技术成功克隆其启动子序列.GUS染色结果表明4个茄子U6启动子(SmU6-1P、SmU6-2P、SmU6-4P 和 SmU6-7P)具有转录活性.构建以 ...     

拟南芥XTH33基因的CRISPR/Cas9高效敲除质粒构建

为解决XTH33基因高效敲除质粒的构建难题,本文对拟南芥CRISPR/Cas9高效敲除质粒的gRNA靶点进行研究,提出靶向拟南芥XTH33基因的gRNA经体外活性检测,可初步筛选高效高活性的gRNA,3条靶向拟南芥XTH33基因的gRNA,XTH33-G3敲除活性最高,达到50％以上,将XTH33-G3靶点插入质粒骨架...     

利用CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术创制抗除草剂西瓜新种质

<正>目的与意义:草害严重威胁了西瓜的产量与品质,然而在中国注册的西瓜除草剂只有5种,且对阔叶杂草控制效果较差,因此急需有效的瓜田杂草控制方案。培育抗除草剂西瓜新品种是解决西瓜田间草害的有力措施,但依靠传统的育种手段几乎无法实现。因此,笔者希望利用CRISPR/Cas9单碱基编辑技术对西瓜ALS基因(编码乙酰乳酸合     

利用CRISPR/Cas9技术创制番茄粉果和无绿肩材料

以栽培番茄品种（系）Ailsa Craig(AC)、B5和B9为试材,利用CRISPR/Cas9双元表达载体系统,对番茄品质调控关键基因SlGLK2和SlMYB12进行定点敲除。获得AC背景下SlGLK2和SlMYB12的基因编辑植株各9株,B5背景下SlGLK2的基因编辑植株3株,B9背景下SlMYB12的基因编辑植株4株。通过对靶点测序发现,在靶位点的PAM上游3～4 bp处发生了不同形式的碱基缺失、插入或替换,主要以1～10 bp的缺失和单碱基G和T的插入为主;也产生了两靶点间的大片段缺失,最大片段为334 bp。AC背景下敲除SlMYB12产生粉色果实,敲除SlGLK2基因,果实肩部的绿色明显变浅,B5背景下的3株基因编辑番茄均无“绿肩”。本研究中利用CRISPR/Cas9技术在不同番茄种质中成功创制了敲除SlGLK2或SlMYB12的基因编辑材料,以期为番茄品质育种提供优良种质。     

利用CRISPR/Cas9系统敲除葡萄中VviEDR2提高对白粉病的抗性

利用CRISPR/Cas9系统定点编辑葡萄白粉病感病基因VviEDR2(Enhanced disease resistance2),在VviEDR2的DUF1336结构域设计靶位点VviEDR2-T1,构建CRISPR/Cas9敲除载体,通过农杆菌介导法转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织。对PCR阳性植株进行靶位点扩增测序,结果表明,共有8个转基因植株在靶位点处发生不同类型的双等位基因突变,编辑效率为32%;突变体植株生长势较弱,叶片较小,茎秆丛生、细弱。进一步对突变体植株进行抗病检测,结果表明,接种葡萄白粉菌(Erysiphe necator Schw.)5d后,突变体植株叶片上白粉菌孢子仅能萌发出少量较短初级菌丝,表皮细胞产生大量明显的H2O2,而野生型叶片中白粉菌萌发出大量初级菌丝、次级菌丝和吸器,无明显H2O2产生。这些结果表明,可以利用CRISPR/Cas9技术编辑葡萄感病基因VviEDR2,提高葡萄白粉菌抗性。     

高效的西瓜CRISPR/cas9基因敲除技术

<正>目的与意义:基因编辑技术在植物基因功能鉴定以及重要农艺性状突变获得方面具有重要应用价值。CRISPR/Cas9基因编辑技术已应用于许多植物物种,成功实现了靶点突变。然而,目前在西瓜上还没有CRISPR/Cas9基因编辑技术相关的研究报道,该技术能否成功应用于西瓜研究及育种仍未可知。以西瓜的ClPDS基因(编码八氢番茄红素脱     

利用发根农杆菌体系检测西瓜CRISPR/Cas9系统的靶位点

西瓜遗传转化技术周期长,过程复杂,CRISPR/Cas9基因编辑系统又存在着一定的脱靶效应,为了保障所选择的靶位点的可行性,本研究选择西瓜ClSPO11-1基因(ID:Cla003301)为靶标,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建双靶点的基因敲除载体,利用发根农杆菌Ar. Qual菌株侵染西瓜子叶外植体,通过简单的组培过程,使西瓜外植体长出不定根,在不定根中检测到了在靶位点1处发生了不同程度的碱基缺失,经过与野生型氨基酸序列比对分析后发现均造成了翻译提前终止和氨基酸的突变,成功实现了对西瓜不定根的基因编辑,该方法周期短,操作简便,实现了快速鉴定在西瓜中选择的靶位点的靶向效率,为研究西瓜基因功能和遗传改良提供了保障。     

基于CRISPR系统的双孢蘑菇基因编辑体系建立及应用

根据CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)基因编辑技术,设计AbPPO4特异性导向RNA,构建双孢蘑菇(Agaricus bisporus)基因编辑载体pAbGEB1-AbPPO4,再通过农杆菌介导转化双孢蘑菇菌丝体建立基因编辑体系,观察菌丝生长状况。结果表明:获得12株转化子,1号和7号的菌丝体中存在潮霉素抗性基因,且AbPPO4基因的相对表达量较低,分别为0.28±0.04和0.47±0.02,与对照组相比,组间差异均具有统计学意义(P0.05),说明1号和7号转化子的菌丝体AbPPO4基因表达受到了抑制;与对照组相比,1号和7号转化子的菌丝体中AbPPO4基因均发生了突变,1号和7号分别产生了4 bp和11 bp的碱基缺失,证明设计的CRISPR/Cas9系统在双孢蘑菇内对AbPPO4基因成功地进行了编辑;同时发现AbPPO4基因突变后对双孢蘑菇菌丝体的生长产生了不利影响。     

冷诱导基因转录因子CBF1转入黄瓜的研究

以抗冷性强的黄瓜"山东5号"为试材,研究冷诱导转录因子CBF1基因对黄瓜抗冷性的影响。从"山东5号"黄瓜基因组DNA中扩增并克隆了冷诱导转录因子CBF1基因,将其与CaMV 35S启动子和Nos终止子融合后构建成植物表达载体pROK2-CBF1。通过花粉管通道法转化黄瓜植株,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株。结果表明:CBF1基因已整合到黄瓜基因组中,转基因植株胁迫期间可溶性糖含量、幼苗含水量显著高于对照;MDA含量、叶片电解质渗透率显著低于对照,黄瓜已具备了较强抗冷性。