口蹄疫病毒3D基因真核表达载体pEGFP-3D的构建及其融合蛋白分子在BHK细胞中的定位

为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况.从重组质粒pMDl8.T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经Barn H Ⅰ/Hind Ⅲ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定.阳性质粒进行测序.利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞.免疫组化检测转染细胞中3D基凶表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达.结果表明,成功构建了重组表达质粒pEGFP-3D,并在BHK-21细胞中进行了表达.免疫组化分析表明,3D蛋白主要定位于细胞核;Western blotting证实pEGFP-3D融合蛋白在80 kDa处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性.pEGFP-3D表达载体转染细胞后很快就能通过观察荧光蛋白而检测出基因的瞬时表达情况,为基因转染研究中确定转染效率、3D的表达情况及蛋白定位等提供了直观的靶标,有望应用于FMDV聚合酶分子的生物学特性研究.     

一个假定微管相关蛋白PEMAP1的克隆和亚细胞定位

微管骨架通过导向纤维素微纤丝的合成来影响细胞壁的结构,在植物生长发育和细胞形态建成过程中发挥着重要作用。微管相关蛋白(microtubule-associated protein, MAP)参与调节微管蛋白亚基的组装、微管的动态稳定以及周质微管的排列方式。因此,对微管相关蛋白的研究有助于更好地理解微管骨架的生物学功能。本研究克隆了一个在拟南芥花瓣中高表达的假定微管相关蛋白PEMAP1 (Petal-expressed microtubuleassociated protein 1),并利用绿色荧光蛋白(GFP)和β-葡糖醛酸酶(GUS)作为报告蛋白对PEMAP1分别进行了亚细胞定位和组织表达模式分析。烟草瞬时表达实验结果表明,pSuper::PEMAP1-GFP能够与微管结合蛋白MBD-RFP共定位,拟南芥中内源启动子驱动的pPEMAP1::PEMAP1-GFP能够与微管株系m CherryTUA5共定位。GUS染色结果表明,PEMAP1启动子驱动的GUS拟南芥转基因株系在下胚轴、花萼和雌蕊的表达较强,在子叶、根部以及花瓣的表达则相对较弱。以上结果说明,PEMAP1很可能作为一个微管相关蛋白参与了拟南芥器官的生长发育与形态建成过程,相关遗传材料的获得为进一步研究PEMAP1的功能提供了工作基础。     

湖羊myogenin重组基因表达及其亚细胞定位的研究

摘 要： [目的]构建湖羊肌细胞生成素（myogenin,MyoG）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白真核表达载体,分析EGFP-MyoG融合蛋白在NIH-3T3细胞的表达及亚细胞定位。[方法]利用PCR技术扩增出MyoG基因完整的CDS,克隆至真核表达载体pEGFP-C1,转染NIH-3T3细胞,荧光显微镜下观察EGFP-MyoG融合蛋白的亚细胞定位,并通过RT-PCR、western blot检测蛋白的表达。[结果]酶切鉴定和DNA序列分析均证实,MyoG基因已正确插入pEGFP-C1中,获得融合蛋白表达载体pEGFP-C1-MyoG,转染NIH-3T3细胞48h后,RT-PCR检测到约680bp的特异性条带,western blot检测出相对分子量约为53kD的融合蛋白,荧光显微镜分析表明,MyoG蛋白定位于细胞核。[结论]融合蛋白EGFP-MyoG在NIH-3T3细胞中成功表达,并定位于细胞核。     

马齿苋多糖双酶法提取工艺优化及其抗氧化性研究

以马齿苋多糖得率为考察指标,通过单因素试验和正交试验优化马齿苋多糖纤维素酶和果胶酶双酶法提取工艺,并对其体外抗氧化活性进行了考察。结果表明,马齿苋多糖最佳提取工艺条件为:液料比25∶1(mL/g),纤维素酶和果胶酶的添加量分别为1.5%和2.0%,酶解温度50℃,酶解时间100 min,在该提取工艺下,马齿苋多糖得率为19.83 mg/g DW。体外DPPH·和·OH清除试验表明,马齿苋多糖对两者均有较好的清除作用,体外抗氧化活性强于VC。     

鸡 CVH启动子调控的绿色荧光蛋白报告载体的构建及鉴定

探索建立一种用绿色荧光蛋白对鸡原始生殖细胞进行标记分离的方法。本研究克隆并测序鸡原始生殖细胞特异表达基因CVH1.6Kb启动子序列。序列分析表明它含有类似于TATA box和CAAT box的元件,在其远端上游区域还有多个GC富含区。将CVH基因启动子亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-1的多克隆位点,成功构建表达载体pCVH-EGFP。重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000介导下分别转染鸡Ⅹ期胚盘细胞和鸡胚成纤维细胞,并于转染后12 h在荧光显微镜下观察转染效果。实验结果显示：在胚盘细胞转染后12 h可观测到绿色荧光表达,转染后24 h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大;在鸡胚成纤维细胞未检测到GFP表达。实验结果说明,由CVH基因启动子控制下的EGFP可在Ⅹ期胚盘细胞特异表达,为利用流式分离技术PGCs标记分离、纯化研究奠定基础。     

酶法提取马齿苋多糖

为了优化马齿苋多糖的提取工艺,将纤维素酶用于提取马齿苋多糖,在单因素实验的基础上,采用L9（34）正交实验法对酶法提取马齿苋多糖的条件进行优化,考察酶用量、酶解温度、pH、酶解时间对马齿苋多糖提取得率的影响。结果表明：最合适的工艺参数为酶用量2.0%、酶解温度40℃、pH6.0、酶解时间110min。该条件下,马齿苋多糖得率达到9.7%。酶法提取纤维素多糖工艺简洁,能量消耗减少,是一种提取马齿苋多糖的的适宜方法。     

马齿苋多糖提取工艺的研究

对马齿苋多糖的提取工艺进行了研究。在对浸提时间、温度、料水比进行单因素试验的基础上,通过正交试验确定了马齿苋多糖提取的最佳工艺条件,即采用微波辅助提取30min以上,料水比1:40,在100℃下浸提5h,浸提2次,提取温度是提取多糖的关键影响因素;提取液采用4倍体积的95%乙醇醇沉4h。     

板蓝根多糖对PRRS弱毒苗免疫猪抗体和T细胞亚群的影响

研究板蓝根多糖对PRRSV弱毒苗免疫抗体和猪外周血T细胞亚群的影响。35日龄断奶仔猪16只随机分为4组,将多糖分别以高、低两个剂量和猪PRRSV弱毒苗同时注射,于免疫后不同的时间点采血,ELISA方法检测猪PRRSV抗体水平,流式细胞术检测猪外周血中T淋巴细胞亚群的变化。弱毒苗免疫后7d,板蓝根多糖高剂量组即可检测到PRRSV阳性抗体,而其它组在免疫后14d,均可检测到PRRS阳性抗体,板蓝根多糖对PRRS弱毒苗产生抗体的影响是和剂量密切相关的,高剂量能提高抗体水平,低剂量会阻碍PRRSV抗体的产生。板蓝根多糖和PRRS弱毒苗联合使用对猪外周血CD3^＋和CD4^＋细胞数量的影响不显著,在早期可促进猪外周血CD8^＋细胞的增殖。合适剂量的板蓝根多糖可以作为免疫增强剂与PRRSV弱毒苗联合使用。     

苜蓿多糖对小鼠淋巴细胞增殖和NK细胞活性影响的研究

为了探讨苜蓿多糖对小鼠免疫功能的影响,从苜蓿中提取苜蓿多糖,通过体外苜蓿多糖对淋巴细胞增殖和NK细胞活性影响的研究,初步确定其免疫调节活性。采用MTT法,检测苜蓿多糖对正常Balb/c小鼠体外脾淋巴细胞增殖的影响和NK细胞对K562细胞杀伤活性的影响。结果表明：苜蓿多糖可以单一激活促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,可以协同ConA刺激T细胞增殖,或协同LPS刺激B细胞增殖,提示苜蓿多糖能够调节机体的细胞免疫和体液免疫功能;苜蓿多糖可以显著地增强NK细胞对K562靶细胞的杀伤活性,提示苜蓿多糖能显著地增强机体非特异性免疫功能。因此,说明苜蓿多糖具有很好的免疫调节效果。     

芦荟多糖及其衍生物的制备与抗氧化活性研究

以新鲜芦荟为原料,采用热水提取多糖,Sevage法除蛋白,再经过透析处理制备得到精制的芦荟多糖,并对其衍生物和生物活性进行研究。芦荟多糖分子质量采用GPC-RI-MALS法测定,多糖结构经过13C NMR表征确证。为了研究芦荟多糖构效关系,对芦荟多糖进行了衍生化,其衍生物包括乙酰化芦荟多糖、磷酸化芦荟多糖和羧基化芦荟多糖。结构表征结果表明,芦荟多糖含有1→4糖苷键,并且为甲基化多糖。分子质量测定结果显示,芦荟多糖的平均分子质量为112 381 u。抗氧化活性测试结果表明,芦荟多糖及其衍生物具有良好的抗氧化活性,其中磷酸化多糖的抗氧化活性与阳性对照品VC相当。构效关系研究表明,磷酸化芦荟多糖其体外抗氧化活性最好。试验为进一步研究芦荟多糖结构、开发功能性食品与药物提供一定的理论依据。     

马齿苋多糖对小鼠的抗衰老作用

用D-半乳糖制备衰老小鼠模型,同时经灌胃100、200、400 mg/马齿苋多糖,观察其对血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量和对动物缺氧存活时间及游泳时间的影响。结果表明,马齿苋多糖能不同程度增加血清中SOD及GSH-Px活力,极显著降低MDA含量。此外,马齿苋多糖还能极显著延长小鼠在缺氧条件下的存活时间和常温游泳时间。说明马齿苋多糖具有明显的抗衰老作用。     

野生蔬菜马齿苋的研究进展

马齿苋是一种珍贵的野生蔬菜资源。它不但营养价值高,而且还具有多种药用功效,被营养专家誉为21世纪最具有前途的绿色食品之一。马齿苋在我国民间的利用历史悠久,近年来也有许多学者开展了对其生物学特性、营养成分、药用价值、开发利用等方面的研究,但在分类学、引种栽培、遗传改良等方面的研究较少,甚至还存在空白。当务之急是必须尽快加强对马齿苋的科学研究,并借助于现代生物学技术对其进行遗传改良。本文提出了对马齿苋进行遗传改良的技术思路。     

广州地区春季叶菜田杂草群落组成及其特征

于春季利用倒置“W”取样法对广州地区不同种植年限及管理水平的叶菜田进行杂草群落调查。结果表明广州地区叶菜田杂草种类共有35种,属12科,25属。其中马齿苋、牛筋草、无芒稗、碎米莎等为主要杂草。种植5年的菜田中以牛筋草+马齿苋+萹蓄等杂草为主;种植10年的菜田中以马齿苋+无芒稗+碎米莎草等杂草为主;长期种植的菜田以马齿苋+碎米莎+凹头苋等杂草为主。种植5年的菜田杂草群落的Shannon-Wiener指数和Pielou指数最大。在高水平管理下的菜田中杂草群落物种丰富度指数最小（4.67）。通过聚类分析表明种植时间和管理水平是影响叶菜田杂草群落结构的主要因素。     

根癌农杆菌介导马齿苋遗传转化体系的研究

利用马齿苋的叶片诱导出愈伤组织,再以愈伤组织为受体建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。利用该转化体系得到抗性愈伤组织后,对其进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定,证实为转化子,表明根癌农杆菌介导外源基因转化马齿苋的愈伤组织是完全可行的,为以后通过基因工程手段进行马齿苋的改良奠定了基础。     

广州地区四季叶菜田杂草群落组成及其生态位

为明确南亚热带地区四季叶菜田杂草群落组成及其生态位,利用倒置“W”九点取样法,对广州地区4个市区16个规模化菜场杂草群落进行季节动态调查。结果表明,春季杂草群落结构以腋花蓼（Polygonum plebeium）+马齿苋（Portulaca oleracea）+光头稗（Echinochloa colonum）为主;夏季以马齿苋+碎米莎草（Cyperus iria）+凹头苋（Amaranthus lividus）为主;秋季以马齿苋+酸模叶蓼（Polygonum lapathifolium）+凹头苋为主;冬季以腋花蓼+碎米荠（Cardamine hirsuta）+酸模叶蓼为主。运用改进的Levins生态位宽度指数和Pianka生态位重叠指数对四季优势杂草生态位进行分析,结果表明,15种优势杂草生态位总宽度大部分在0.50以上,其中生态位总宽度生态位宽度大于1.00的有马齿苋（1.22）、腋花蓼（1.15）、酸模叶蓼（1.08）。夏季生态位重叠指数达到0.50的最多,秋季则最少。生态位重叠指数最大的3组杂草分别为春季的马唐（Digitaria sanguinalis）和牛筋草（Eleusine indica）（0.87）,夏季的马齿苋和凹头苋（0.82）以及马齿苋和牛筋草（0.80）。     

广州市叶菜田杂草群落组成及其年动态变化

于2008年利用倒置“W”九点取样法对广州市叶菜田杂草群落年动态变化进行了调查。调查共计发现60种杂草,属23科,45属。春季杂草群落为马齿苋(Portulaca oleracea)+繁缕(stellaria media)+腋花蓼（Echinochloa colonum）为主;夏季以马齿苋+碎米莎草（Cyperus iria）+凹头苋（Amaranthus lividus）为主;秋季以马齿苋+凹头苋+光头稗（Echinochloa colonum）为主;冬季以腋花蓼+繁缕+酸模叶蓼（Polygonum lapathifolium）为主。通过计算杂草的优势度得出全年危害最严重的杂草为马齿苋、繁缕、腋花蓼、酸模叶蓼、凹头苋、碎米莎草、马唐（Digitaria sanguinalis）、牛筋草（Eleusine indica）、光头稗、小藜（Cardamine hirsuta）等10种。其中,马齿苋、凹头苋、碎米莎草在春夏秋季为优势杂草;马唐在夏秋冬为优势杂草;光头稗、牛筋草为春秋季优势杂草;繁缕、腋花蓼、酸模叶蓼、小藜为冬春季优势杂草。     

马齿苋药用价值及其保健制品的研究进展

综述了马齿苋的活性物质及有效成分抑肿瘤、糖尿病及抗菌消炎、抗氧化、降血脂等药理作用的研究进展,阐述马齿苋加工保健品及药剂的开发利用价值,为马齿苋有效成分的深入研究与开发利用提供参考依据。     

马齿苋加工研究进展

综述了马齿苋的化学成分及其药理学功效,归纳了马齿苋活性成分的提取方法,介绍了马齿苋多种加工产品,并提出了存在的问题以及建议,以期为马齿苋功能食品开发和深加工提供参考。