乳牛衣原体病灭活疫苗的研制

将免疫原性稳定的鹦鹉热衣原体SX5菌株灭活，加入油佐剂制备乳牛衣原体病灭活疫苗，并对疫苗的安全性进行了检测。用该疫苗对成年牛和犊牛进行了最小免疫量试验、效力试验和免疫持续期试验；结果表明，最小免疫量分别为3mL和5mL，平均免疫保护率达94．4％。免疫持续期达10个月。疫苗保存期试验表明，在4℃条件下可保存12个月。本动物安全试验和田间小试免疫证明，该疫苗安全性好，乳牛注射疫苗后饮食、产乳量及注苗部位没有明显的异常变化。     

隐性乳腺炎乳牛乳样中苏云金芽孢杆菌的分离与鉴定

自2002年10月起，笔者从西安及其周边地区乳牛中随机抽取48头共184个乳室，进行了乳牛隐性乳腺炎的调查及病原菌分离鉴定。共分离出3株革兰氏阳性芽孢杆菌，初步鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。该菌的培养特性及形态与蜡样芽孢杆菌极为相似；小白鼠腹腔注射可致其死亡，证明该菌所产毒素毒力较强。     

奶牛乳腺炎无乳链球菌毒力相关因子

链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是引起奶牛乳腺炎的3大病原菌，在链球菌属中无乳链球菌是引起奶牛乳腺炎的重要病原菌之一，由无乳链球菌导致的乳腺炎约占隐性乳腺炎发病率的56.25%。无乳链球菌入侵奶牛乳腺的过程主要包括感染、黏附上皮细胞、侵入上皮细胞、损伤机体和免疫逃避等过程。无乳链球菌的毒力因子具有附着和侵袭机体细胞的作用，使菌体在奶牛乳腺表面形成生物被膜，进而干扰机体的正常免疫功能并引起疾病。本文主要阐述了无乳链球菌在入侵乳腺组织过程中发挥主要作用的毒力因子的种类、作用机制以及调控过程，旨在通过抑制其相关毒力因子的活性，从而阻断无乳链球菌在乳腺中感染和传播，进而为预防和治疗链球菌型乳腺炎提供新的思路。     

不同佐剂乳牛乳腺炎多联灭活疫苗的免疫试验

用4种不同佐剂乳牛乳腺炎多联疫苗进行兔免疫攻毒试验。结果，蜂胶疫苗效果最好，铝胶疫苗次之。对昆明系小白鼠注射蜂胶疫苗和铝胶疫苗后第30d金黄色葡萄球菌抗体水平达到最高，无乳链球菌和停乳链球菌抗体在第21d达到峰值。在免疫健康泌乳牛的试验中，3种佐剂疫苗的免疫效果依次为蜂胶疫苗、油疫苗和铝胶疫苗；与对照组相比，免疫效果均显著(P＜0．05)。     

猪后海穴接种猪传性胃肠炎疫苗对母乳及仔猪血清中IL—2含量的影响

应用放射免疫分析方法，测定比较了猪后海穴穴位免疫与常规口服、肌肉途径免疫猪传染性胃肠炎疫苗后，母猪初乳、常乳免疫仔猪血清中IL-2的含量。结果表明，初服中IL-2的含量以穴位免疫最高；常乳中IL-2含量各种免疫途径基本一致，处于较低水平。仔猪免疫后3d，血清中IL-2含量，穴位免疫与口服免疫基本一致，但均高于肌肉免疫及对照；免疫后7d，血清中IL-2含量，穴位免疫高于口服、肌肉免疫。从免疫调节因子方面看出，后海穴对动物机体免疫功能具有正向促进作用。     

奶牛乳房炎多联苗抗原配比及抗人工感染试验的研究

为了进一步提高乳房炎多联苗免疫效果及评价疫苗免疫后的抗感染效果,试验从临床型乳房炎患牛奶样中分离、筛选出毒力及交叉免疫原性强的无乳链球菌(W271)、停乳链球菌(T2531)和金黄色葡萄球菌(J84184)3株优势血清型菌株,制备每剂量(5 mL)中含3种菌的抗原浓度分别为2.5×109CFU、5×109Cfu、1×1010CFU和2×1010CFU的4种氢氧化铝灭活多联苗,将每种疫苗于肩胛部肌肉免疫4头牛,每头牛免疫2次(0天和14天),每次5 mL,分别于免疫前后第28天采血,用间接ELISA方法检测免疫前后血清抗体水平.结果表明:免疫剂量与抗体效价具有显著相关性,随着菌苗中3种菌抗原浓度的增加,免疫后的3种菌血清抗体水平亦增加;用检验用的无乳链球菌(W117)、停乳链球菌(T1030)和金黄色葡萄球菌(J88014)进行免疫攻毒保护试验,结果血清抗体效价与免疫攻毒保护效果具有显著相关性,当免疫后抗体水平达到免疫前的2倍以上时,免疫后的奶牛即具有较好的保护效力.     

后海穴免疫与常规免疫奶牛乳腺炎三联灭活苗的效力比较

本研究旨在通过对奶牛乳腺炎三联灭活苗在后海穴注射免疫与常规注射免疫的效力比较,寻找更为有效、方便的免疫途径。本试验以荷斯坦奶牛为试验动物,分别在后海穴、臀肌和皮下接种乳腺炎灭活疫苗,比较其免疫效力,结果显示后海穴免疫首先能节省疫苗用量,同时还可以提前产生免疫力,显著提高(P<0.01)血清中的抗体水平;其次接种疫苗时因针刺穴位的作用,显著提高了血液中的白细胞总数和淋巴细胞数,增强了免疫细胞的功能;最后显著降低(P<0.01)乳汁中的体细胞数。     

SIP亚单位疫苗对无乳链球菌诱导小鼠乳腺炎的保护力评价

无乳链球菌是导致奶牛乳腺炎的重要病原菌,本研究评价了SIP(surface immunogenic protein)亚单位疫苗对小鼠无乳链球菌乳腺炎的免疫保护效果。制备无乳链球菌SIP亚单位疫苗和灭活疫苗,对小鼠进行免疫,并设PBS阴性对照。免疫前后采血测定IgG及IgG亚类的抗体滴度。免疫小鼠分娩后第4天,进行无乳链球菌乳腺攻毒试验。24h后扑杀攻毒鼠,进行乳腺内CFU的测定,制作并观察乳腺组织病理切片。结果显示,SIP亚单位疫苗免疫组IgG及IgG亚类抗体滴度显著高于灭活疫苗组(P0.01)。免疫哺乳小鼠乳腺攻毒后,SIP亚单位疫苗免疫组小鼠乳腺CFU显著低于灭活疫苗组及对照组(P0.001)。乳腺病理切片显示SIP亚单位疫苗组乳腺组织结构较对照组完整,且中性粒细胞浸润程度最小。本研究表明,无乳链球菌SIP亚单位疫苗有望作为奶牛无乳链球菌乳腺炎的候选亚单位疫苗。     

鸡传染性鼻炎多价油乳剂灭活苗的免疫对比及田间试验

从山东省分离了６株鸡传染性鼻炎菌株,经过抗原比较,攻毒交叉保护试验,发现ＨＰＧ－ＨＺ株的保护性最佳,利用ＨＰＧ－ＨＺ株与标准Ａ型菌株ＨＰＧ－００８３株和标准Ｃ型菌株ＨＰＧ－Ｍｏｄｅｓｔｏ株结合,成功研制了鸡传染性鼻炎多价油乳剂灭活苗。将该疫苗在山东省、河北省、河南省等地共４５００万只鸡进行田间免疫试验和与同类疫苗的对比试验,结果表明,鸡传染性鼻炎多价油乳剂灭活苗对鸡群安全、有效,无副作用,免疫期可达６个月以上。特别对山东分离株的免疫保护比进口和国产同类疫苗均有优势。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）灭活疫苗菌株，本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株，测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价，并进行了攻毒保护试验。结果显示，分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多，均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因；免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应，在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128，强毒攻毒后全部存活，而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明，Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株，其中Pm3作为首选株。     

快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立

本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类 M 蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1 μL(20 pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10 CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。     

Streptococcal Cellulitis Following Preparation of Fresh Raw Seafood

We describe three zoonotic streptococcal soft tissue infections resulting from fresh seafood contact. One was a localized thumb infection with Streptococcus iniae in an immunocompetent healthy young male resulting from a puncture wound from a crab pincer. The other two were cases of ascending upper limb cellulitis associated with bacteraemia in mastectomy patients. One of these infections was caused by S. iniae while the other was caused by Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae, a species that has not been previously described as a cause of zoonotic infection. Hence when cleaning raw seafood, protective equipment should be used to minimize the risk of percutaneous injuries.     

猪链球菌病双重PCR诊断方法的建立

根据猪链球菌2型荚膜多糖和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的保守区序列分别设计了2对简并引物,建立了一种能同时检测猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法。结果显示,该双重PCR能从100个细菌的混合纯培养物中扩增出2条目的片段。而且可以直接从病料组织中检测到相应的病原菌。用建立的双重PCR方法和细菌分离培养法平行检测人工感染的组织病料,PCR方法与细菌培养法的阳性检出率基本一致,但PCR方法的特异性好、敏感性高,简便易行,可以用于猪链球菌病的流行病学调查和实验室的快速鉴别诊断。     

我国奶牛乳房炎无乳链球菌抗生素耐药性研究

为了查明我国奶牛乳房炎无乳链球菌对抗生素耐药情况,指导临床合理用药,从我国部分地区奶牛场采集的临床型奶牛乳房炎病乳中分离鉴定出无乳链球菌115株,采用K-B纸片法测定了这些菌株对抗生素的耐药情况。结果表明,无乳链球菌对目前临床上使用的大部分抗生素,如头孢唑啉、头孢噻肟、丁胺卡那霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、强力霉素、麦迪霉素、林可霉素、氟苯尼考、多黏菌素B、环丙沙星、氟哌酸、氨苄青霉素/舒巴坦、头孢噻肟/棒酸和头孢他啶/棒酸均比较敏感;但对青霉素G、氨苄青霉素、链霉素、恩诺沙星、阿莫西林/棒酸和复方新诺明等有一定耐药性,其耐药率达50%～100%。     

Culture results from milk samples submitted to veterinary diagnostic laboratories from August 2003 to December 2006 in New Zealand

Abstract

AIMS: To determine the pattern of isolation of major mastitis-causing organisms isolated from milk samples submitted to five veterinary diagnostic laboratories in New Zealand.

METHODS: The culture results of 25,288 milk samples that were collected from dairy cows throughout New Zealand from August 2003 to December 2006 and submitted to a group of veterinary diagnostic laboratories were assembled, reviewed and summarised. Logistic regression was used to analyse the effect of year, region (i.e. North vs South Island), and season on the probability of isolating the two most common organisms.

RESULTS: The most commonly isolated mastitis causing organisms from all samples were: Streptococcus uberis (23.6%), Staphylococcus aureus (23.5%), coagulase-negative staphylococci (CNS; 7.2%), Strep. dysgalactiae (6.2%), Bacillus spp. (4.0%), and coliforms (3.7%). The percentage of samples with isolates of Strep. uberis or Staph. aureus was affected by island, year and season (p<0.001). For most of the year, except in late winter and early spring when Strep. uberis was much more common, the percentage of isolates of Strep. uberis and Staph. aureus were not apparently different despite the former being an environmental pathogen and the other a contagious one.

CONCLUSION: The pattern of isolation of major mastitis-causing organisms, as determined from culture of milk samples submitted to diagnostic laboratories in New Zealand, has changed significantly over the last 40 years, with a substantial increase in the percentage of isolates that are Strep. uberis and a decrease in isolates of Strep. agalactiae. There is a clear seasonal pattern to the isolation of both Strep. uberis and Staph. aureus, particularly the former.

CLINICAL RELEVANCE: Knowledge of the aetiological agents causing bovine mastitis on a farm is of value in determining the choice of treatment. This dataset shows that, although there is seasonal pattern to the isolation of mastitis-causing organisms in New Zealand, both Strep. uberis and Staph. aureus are isolated throughout the year, so bacteriology is of value in determining aetiology even in late winter/early spring.     

猪链球菌精氨酸脱亚氨酸酶序列分析及其PCR检测

对9株猪链球菌2型重庆分离株的精氨酸脱亚氨酸酶基因进行克隆测序,结果表明该基因长度为1231bp,与Genbank发表的该基因序列相比,核苷酸同源性高于99%,推导的氨基酸同源性高于96%。根据精氨酸脱亚氨酸酶基因的测序结果建立扩增片段长度为237bp的PCR检测方法,35株猪链球菌致病株中,30株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,有5株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;14株正常猪扁桃体分离株中,11株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,3株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;猪链球菌1型、7型、9型、13型、1/2型各一株,均能扩增出精氨酸脱亚氨酸酶基因的片段。     

猪脑膜脑炎链球菌病的诊断与预防

2000年3－6月哈尔滨市某场断奶后仔猪发生一起以急性、热性、并具有明显神经症状的传染病。发病率和死亡率分别为66．7％（60／90）和50％（30／60）。经流行病学、临床症状、细菌培养和病理组织学检查确诊为脑膜脑炎型猪链球菌病。     

2种猪源链球菌对猪、兔的致病性试验

检测了4株猪链球菌2型(Streptococcus suistype 2,SS2)和2株马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.zooepidem icus,SEZ)对猪、兔的致病性。SS2-1、SS2-H及SS2-006444株均分离自发病猪内脏,前2株毒力因子表现型为MRP+EF+SLY+,后者为MRP-EF-SLY-;SS2-D株为国外引进的SS2人源株,作为对照,其毒力因子的表现型为MRP+EF*SLY+;SEZ-CY和SEZ-CN株均分离自发病猪并经鉴定。SS2-1、SS2-H、SEZ-CY和SEZ-CN株对猪(2~3头/组)的最小致死量分别为106、107、104和108cfu;对兔(2~3只/组)的最小致死量分别为100~1 000、1 000、100和105cfu;SS2-D株108cfu对猪不致死,对兔的最小致死量为108cfu,而SS2-006444对猪、兔无致病性。显示SS2毒力因子与其对猪、兔的致病性有关;SS2与SEZ菌株对兔或猪的致病性一致,可用兔取代猪做试验;SS2和SEZ菌株通过腹腔、皮下、肌肉或静脉注射均可感染兔(2~4只/组),并致死,SEZ还可经口、鼻感染;SEZ与SS2静脉感染猪后10 m in即可检出细菌,此后2~4 h为无菌血症阶段,之后重新出现。     

多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用

参照GenBank发表的序列，在金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌16SrRNA与23SrRNA之间的区域设计了3对引物，参照念珠菌和隐球菌的18SrRNA的序列设计1对引物，建立了检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法。参照Skladny的方法制备模拟了细菌感染l临床标本。结果表明：本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性，多重PCR方法检测乳样中的金黄色葡萄球菌的细菌最小浓度为10^4CFU／mL，检测无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的细菌最小浓度分别为10^4CFU／mL、10^3CFU／mL和10^3CFU／mL。通过对采自临床型乳腺炎（46个）和隐性乳腺炎（167个）动物共计213个乳样分别用传统细菌学培养法和多重PCR方法进行检测，多重PCR对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有更高的检出率（P〈0．01），但该方法对无乳链球菌和停乳链球菌的检出率与培养法差异不显著（P〉0．05）。