鸡包涵体肝炎病毒DNA探针的制备及其原位杂交的应用

用限制酶HirdⅢ和Ecorl双切鸡包涵体肝炎六邻体蛋白基因片段重组质粒，得到大小636bp的基因片段，用地高辛标记制备DNA探针，其灵敏度为0．1～0．3ng／μL。用该探针对感染鸡包涵体肝炎病毒的雏鸡肝组织进行原位杂交，结果表明病毒经口感染后12h肝细胞内出现病毒的复制，3～7d时病毒复制明显，9～16d病毒复制减弱。原位杂交表明鸡包涵体肝炎病毒主要定位于核内，同时也可进入胞浆中。地高辛标记鸡包涵体肝炎病毒DNA探针对检测该病毒DNA的灵敏度高，特异性强，操作方便，该探针可用于本病的分子病理学研究和特异性诊断。     

鸡SP-mRNA探针制备及其在INR的杂交反应

应用RT-PCR方法从鸡脑中扩增P物质（Substance P,SP）基因片段,将其连接于pGM-T质粒并转化大肠杆菌,挑取阳性克隆,测序鉴定为目的片段。分别利用pGM-T质粒中T7和SP6启动子及T7和SP6RNA聚合酶,以线性化的SP/pGM-T为模板转录合成正、反义DIG标记RNA探针。通过原位杂交（in situ hybridization histochemistry,ISHH）技术,用新合成的探针探查SP-mRNA在鸡肠Remak神经（Intestinal nerve of Remak,INR）中的分布情况。结果表明,鸡INR中SP-mRNA阳性神经元数量众多,在空、回肠段和直肠段INR中的阳性细胞分别占总神经元的82.98%和98.01%。阳性细胞呈多突起的椭圆形或梭形,在INR神经节中较有规律地层状分布或成群出现,在神经节边缘分布更为密集,并且在节间束也有少量的阳性细胞分布。本研究从基因水平证明INR中大部分神经元有SP的mRNA转录,这些神经元作为外来的SP神经纤维可以支配到肠道和输卵管。     

原位杂交检测鸡传染性支气管炎病毒

本文以鸡传染性支气管病毒 Ｈｏｌｔｅ 株 Ｓ１ 基因为基本材料制备 Ｄｉｇ 标记的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针,首次以原位杂交技术检测了肾病型传染性支气管炎病毒感染鸡体内的 Ｉ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 分布情况。结果表明,病毒感染后第３～７ 天, Ｉ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 主要分布于肾脏,且主要位于肾小管上皮细胞核内, Ｉ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 在其它器官中分布甚少。 Ｉ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 的分布数量与所在器官的组织病变有一定关系。     

16SrRNA寡核苷酸探针原位杂交法在粪便微生物研究中的应用

16SrRNA寡核苷酸探针(以下简称16SrRNA探针)原位杂交法, 可简单、快速和准确地对粪便微生物进行定性和定量测定,本文对该方法及其应用作一综述.     

DNA探针鉴定转基因鸡早期性别

质粒ｐＵＧＤ１２０１经扩增、提取、纯化、酶切等一系列过程而获得了Ｗ染色体特异性ＤＮＡ片段,继而获得用地高辛标记的Ｗ染色体ＤＮＡ探针。用该探针通过原位杂交法对鸡Ｘ期胚盘细胞成功地进行了性别鉴定。     

Cdc25B mRNA在早期鸡胚中的动态表达

本试验旨在研究Cdc25B mRNA在早期鸡胚中的时空表达模式。通过分子克隆的方法获得Cdc25B基因特异性目的片段,并用体外转录的方法合成了Cdc25B RNA探针,通过全胚胎原位杂交的方法检测了早期不同发育阶段鸡胚中的Cdc25B mRNA水平。结果表明,Cdc25B的杂交信号主要分布于中枢神经系统(CNS)、体节和肢芽的顶端,在尾部神经上皮中缺乏杂交信号。早期阶段,Cdc25B的杂交信号不对称地分布在亨氏节的左侧。随着胚胎的发育,Cdc25B的杂交信号逐渐增强,并且在即将封闭的神经管中,杂交信号呈现出腹背递减的浓度梯度。然而,在早期各个阶段,脊索都是阴性的。这些结果提示,Cdc25B在前、后期的CNS、体节和肢芽发育中可能发挥不同的功能,这种功能的改变可能与Cdc25B的表达浓度有关。此外,鸡胚胎内部器官的左右不对称性发育可能是Cdc25B与其它基因共同调控的结果,这些调控发育的机制可能是Cdc25B蛋白参与了细胞周期进程,调控细胞增殖或分化。     

鸡大肠杆菌traT基因的扩增及TraT-DIG探针制备

以致病性Ｅ．ｃｏｌｉ的质粒为模板,用人工合成引物扩增出致病性相关的ｔｒａＴ基因核心部分;将菌株的致病性与ｔｒａＴ基因的扩增结果进行比较,强致病力菌株均扩增出ｔｒａＴ基因,无致病力菌株未扩增出ｔｒａＴ基因,约大多数中等致病力菌株亦扩增出ｔｒａＴ基因。扩增获得的ｔｒａＴ基因经纯化后标记地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｎ,ＤＩＧ）研制出ｔｒａＴ－ＤＩＧ基因探针,该探针与鸡沙门氏菌、鸡白沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌不发生     

绵羊肺腺瘤病毒JSRV-2基因探针的制备与原位杂交检测

用地高辛随机引物法标记外源性exJSRV特异的JSRV-2片段，制备探针，用原位杂交法检测自然感染绵羊肺腺瘤病（oPA）的病肺组织中JSRV-NM的RNA及前病毒DNA，结果表明’OPA患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有JSRV-2基因mRNA的表达，同时也检测到了前病毒DNA，而相应的阴性对照无阳性信号，证实外源性JSRV-NM病毒具有特异性的DNA探针在检测致瘤性前病毒在宿主细胞中的整合具有可信度。     

地高辛标记探针原位杂交检测猪延髓TPH2 mRNA的表达

为了从组织学水平研究色氨酸羟化酶2(TPH2)在猪体的表达通路,探讨5-羟色胺(5-HT)与猪厌食、呕吐的关系,试验采用PCR法对猪TPH2 cDNA探针进行地高辛(digoxigenin,DIG)标记,应用核酸分子原位杂交技术检测猪延髓组织内TPH2 mRNA的表达。结果表明:地高辛标记的TPH2cDNA探针使用简便,灵敏度高,特异性强,杂交结果直观,探针保存时间较长,无放射性污染;猪延髓组织内的血管壁、蛛网膜、下橄榄核区与极后区的神经元均有阳性反应,TPH2 mRNA的表达较高,提示了TPH2在这些部位的存在与5-HT的转运具有相关性。     

原位杂交检测鸡肿瘤病

本研究旨在运用原位杂交检测方法检测鸡的肿瘤病。根据GenBank中登录的MDV、ALV-J和REV参考毒株序列,设计并合成3对引物,经PCR方法扩增出相应的片段,并进行了克隆测序。将测序正确的片段亚克隆至pSPT-18,经转录得到DIG标记的特异cRNA探针。将探针分别与3种肿瘤病阳性组织石蜡切片进行杂交,可看到阳性信号,特异性、敏感性较好。运用该方法对32份疑似肿瘤病料进行了检测,MDV、ALV-J和REV的阳性率分别为25.00%、18.75%和3.13%。结果提示,鸡肿瘤病在鸡场中仍广泛存在。     

家蚕微孢子虫原位杂交诊断技术研究

根据家蚕微孢子虫rRNA基因高度保守的特点,设计合成了1对PCR引物,从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增出1个12kb片段,用同位素标记后作为检测家蚕微孢子虫的特异性探针。采用原位杂交的方法,对家蚕卵及感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫进行原位杂交检测。实验结果表明,该方法可以从家蚕单粒卵内检测到296粒孢子,对感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫均有阳性杂交信号出现。     

鸡IL-1β cDNA克隆和序列分析及原位杂交检测

根据国外报道的鸡 IL- 1β序列 ,设计引物 ,以提取的鸡外周血单个核细胞总 RNA为模板 ,RT- PCR扩增 IL- 1β c DNA全序列。将 RT-PCR产物与 p UC19载体相连 ,转化大肠杆菌 ,经 PCR、酶切分析及序列测定得知所克隆序列与报道序列同源性达 99%以上 ,证明所克隆基因为目的基因。用地高辛随机引物法标记 IL- 1βc DNA制备探针 ,原位杂交检测禽脑脊髓炎病鸡与正常鸡脑组织中 IL- 1β m RNA表达情况 ,结果表明脑炎病鸡脑中 IL - 1β m RNA表达水平高于正常鸡。     

Detection of Water Buffalo Sex Chromosomes in Spermatozoa by Fluorescence in situ Hybridization

In order to identify X‐ and Y‐bearing spermatozoa in water buffalo by fluorescence in situ hybridization (FISH), some available probes of closely related species were examined. An X‐ and Y‐specific probe set, made from flow sorted yak chromosomes, labelled in somatic metaphases of water buffalo the whole X and Y, respectively, except their centromere regions. A cattle Y‐chromosome repeat sequence (BC1.2) showed strong signal on the telomere region of the buffalo Y‐chromosome, demonstrating the evolutionary conservation of this locus in water buffalo. In hybridization experiments with spermatozoa from five buffaloes, the yak X‐Y paint set demonstrated clear signals in more than 92% (46.8% X and 45.8% Y) of the cells. Using the cattle Y‐chromosome specific BC1.2 probe, clear hybridization signal was detected in more than 48% of the cells. Statistical analysis showed that there was no significant difference between bulls or from the expected 50 : 50 ratio of X‐ and Y‐bearing cells. The probes presented here are reliable to assess separation of X‐ and Y‐bearing spermatozoa.     

寡核苷酸探针原位检测石蜡切片中PRRSV核酸

根据GenBank收录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332株ORF6和ORF7基因序列，用O1igo软件设计并合成大小为37bp的寡核苷酸探针，经生物素标记后，成功建立了原住检测石蜡组织切片中PRRSV核酸的方法。该探针能检测到56PgPRRSV核酸的RT—PCR产物DNA，能特异检测出PRRSV核酸及其PCR产物，而对猪瘟病毒（HCV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪乙脑病毒（JEV）的核酸呈阴性反应。应用该方法检测PRRSVSC-1株人工感染的28日龄仔猪，在感染后7d即可在肺脏、肾脏、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、十二指肠和大脑检测到PRRSV核酸。该法可用于仔猪PRRSV感染的诊断和组织中核酸的定位及分布研究，也可用于甲醛固定组织的回顾性诊断。     

光敏生物素标记核酸探针检测A群轮状病毒的研究

采用光敏生物素标记Ａ群轮状病毒（ＧＡＲＶ）全基因组ＲＮＡ,制备了ＧＡＲＶ群特异核酸探针,该探针与样品进行打点杂交,经亲和素－碱性磷酸酶（ＡＶ－ＡＰ）系统显色,可检出１００ｐｇ病毒ＲＮＡ序列。试验表明轮状病毒光敏生物素核酸探针具有特异、灵敏、稳定的特点,可用于ＧＡＲＶ的检测和进行基因相关性研究。     

用原位杂交对BHK-21细胞中的FMDV定位和检测

为了明确FMDV在细胞内的增殖部位，建立检测细胞内低拷贝FMDV的方法，对试验接种FMDVO／Akesu／58（10^7TCID50）毒株的BHK-21细胞中2～10h不同时间段的病毒RNA进行检测和定位。选用FMDVRNA非结构蛋白区3D保守序列作为寡核苷酸探针，采用尾段标记法以地高辛-11-d UTP标记，用原位杂交敏感加强型试剂盒检测杂交体。结果显示，从感染FMDV后2～10h内的BHK-21细胞中检测出阳性染色的病毒粒子，这些病毒粒子大多集中在核周围，随感染时间延长阳性染色信号增强。这说明用寡核苷酸探针与敏感加强型试剂盒结合对检测细胞内低拷贝的病毒粒子是可行的，同时也从分子水平上证明FMDV主要在细胞质中进行复制和繁殖。     

短乳杆菌的分离鉴定及其对鸡肠粘膜SIgA分泌的影响

用RS培养基，从SPF鸡的消化道分离到1株乳酸杆菌。该菌生长速度快，耐酸，耐胆汗，对肠道粘膜有较强的粘附力，能提高鸡肠粘膜的SIgA滴度。对该菌的形态特征、培养特性、生理生化特性、药物的敏感性及G C等进行试验，证明该菌为短乳杆菌。该菌可作为禽用闪生素的候选菌株。